[發(fā)明專利]一種提高重金屬污染土壤中植物抗性的雙接菌方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810030597.2 | 申請日： | 2018-01-12 |
| 公開（公告）號： | CN108277173A | 公開（公告）日： | 2018-07-13 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 方臨川;鞠文亮;王云強;劉磊;韋革宏 | 申請（專利權(quán)）人： | 西北農(nóng)林科技大學(xué) |
| 主分類號： | C12N1/20 | 分類號： | C12N1/20;B09C1/00;B09C1/10;C12R1/41;C12R1/07 |
| 代理公司： | 北京方圓嘉禾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11385 | 代理人： | 董芙蓉 |
| 地址： | 712100 陜西*** | 國省代碼： | 陜西;61 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 重金屬污染土壤 植物抗性 根瘤菌 接菌 重金屬 促生 菌株 接種 凍樣芽孢桿菌 生物修復(fù)技術(shù) 植物生物量 催芽處理 管理措施 污染地區(qū) 芽孢桿菌 養(yǎng)分循環(huán) 苜蓿種子 菌懸液 野生型 構(gòu)建 菌膠 礦區(qū) 苜蓿 毒害 土壤 緩解 | ||
1.一種提高重金屬污染土壤中植物抗性的雙接菌方法，其特征在于，包括以下步驟：
步驟一：菌株的培養(yǎng)與菌懸液的獲取：
雙接種體系所用的菌株為根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020和促生菌膠凍樣芽孢桿菌P.Mucilaginosus ACCC10013；
菌株培養(yǎng)過程中所用的培養(yǎng)基如下：
YMA固體培養(yǎng)基：10g/L甘露醇，3g/L酵母粉，0.5g/L K2HPO4，0.2g/L MgSO4·7H2O，0.1g/L NaCl，17g/L瓊脂，pH為6.8～7.2
TY液體培養(yǎng)基：5.0g/L胰蛋白胨，3.0g/L酵母粉，0.7g/L CaCl2·2H2O，pH為6.8～7.2
改良ACCC55固體培養(yǎng)基：10.0g/L蔗糖，0.5g/L酵母粉，0.5g/L K2HPO4·3H2O，0.2g/LNaCl，0.2g/L MgSO4·7H2O，1.0g/L CaCO3，15.0～20.0g/L瓊脂，pH為7.0～7.2
優(yōu)化液體培養(yǎng)基：2.5g/L麥芽糖，1.0g/L胰蛋白胨，0.73g/L MgSO4·7H2O，0.4g/LK2HPO4·3H2O，0.06g/L NaCl，0.6mg/L FeCl3，10mg/L水楊酸，1.0g/L CaCO3，pH為7.0～7.2
S.meliloti菌株首先在YMA固體培養(yǎng)基中活化，然后將S.meliloti菌種接種到Y(jié)MA固體培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)3d后，挑取菌落，轉(zhuǎn)化，使菌株活化，并純化分離出單一菌落，最后把活化好的菌株接種于TY液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h直至OD600為0.8，培養(yǎng)液于8000rpm，4℃離心5min收集菌體，菌體用無菌去離子水清洗2～3次，重新懸浮于去離子水中的即為實驗所需菌懸液，菌懸液需現(xiàn)用現(xiàn)配；
P.Mucilaginosus菌株首先在改良的ACCC55固體培養(yǎng)基中活化，然后將P.Mucilaginosus菌株接種到ACCC55固體培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)3d后，挑取菌落，轉(zhuǎn)化，使菌株活化，并純化分離出單一菌落，最后把活化好的菌株接種于優(yōu)化液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h直至OD600為0.8，培養(yǎng)液于8000rpm，4℃離心5min收集菌體，菌體用無菌去離子水清洗2～3次，重新懸浮于去離子水中的即為實驗所需菌懸液，菌懸液需現(xiàn)用現(xiàn)配；
步驟二：苜蓿種子催芽處理
步驟三：雙接菌處理
將1.3kg的銅礦區(qū)和鉛鋅礦區(qū)農(nóng)業(yè)土壤分別裝入花盆中，花盆下面墊上細紗網(wǎng)以防土壤以及土壤中重金屬淋失，控制土壤含水量為土壤田間持水量的70％，土壤平衡一周后，將已經(jīng)催芽至1-2cm的20株苜蓿植入土壤中；待紫花苜蓿長出第一片真葉，將20mlS.meliloti菌懸液和P.Mucilaginosus菌懸液用注射器添加到植物根部，每隔一周接菌一次，共接菌3次。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高重金屬污染土壤中植物抗性的雙接菌方法，其特征在于，步驟二中，苜蓿種子催芽處理，具體為：
(1)選擇優(yōu)良的苜蓿種子，盡量保證種子大小均勻；
(2)將步驟(1)中挑選的苜蓿種子用75％的乙醇溶液浸泡10min，之后用蒸餾水沖洗3-5次，接著用20％的次氯酸鈉溶液浸泡10min，再用蒸餾水沖洗3-5次，最后用蒸餾水浸泡30min，直到種子處于鼓脹狀態(tài)；
(3)將步驟(2)消過毒的種子平鋪放到裝有瓊脂液的培養(yǎng)皿中，然后將培養(yǎng)皿放到25℃的培養(yǎng)箱里面培養(yǎng)催芽1d。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高重金屬污染土壤中植物抗性的雙接菌方法，其特征在于，步驟三中，雙接菌處理，具體為
(1)將1.3kg的銅礦區(qū)和鉛鋅礦區(qū)農(nóng)業(yè)土壤分別裝入花盆中，花盆下面墊上細紗網(wǎng)以防土壤以及土壤中重金屬淋失，控制土壤含水量為土壤田間持水量70％；
(2)用鑷子將已經(jīng)催芽至1-2cm的20株苜蓿植入步驟(1)已經(jīng)平衡一周的污染土壤中；
(3)待步驟(2)污染土壤中紫花苜蓿長出第一片真葉，用注射器將20ml S.meliloti菌懸液和P.Mucilaginosus菌懸液添加到植物根部；
(4)按照步驟(3)每隔一周混合接種菌懸液一次，共接菌3次。
該專利技術(shù)資料僅供研究查看技術(shù)是否侵權(quán)等信息，商用須獲得專利權(quán)人授權(quán)。該專利全部權(quán)利屬于西北農(nóng)林科技大學(xué)，未經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)許可，擅自商用是侵權(quán)行為。如果您想購買此專利、獲得商業(yè)授權(quán)和技術(shù)合作，請聯(lián)系【客服】
本文鏈接：http://www.szxzyx.cn/pat/books/201810030597.2/1.html，轉(zhuǎn)載請聲明來源鉆瓜專利網(wǎng)。
