[發明專利]利用CRISPR/Cas9技術構建Hutat2:Fc基因敲入單核細胞的實驗方法

有效

• 申請號: 201810028924.0
• 申請日: 2018-01-12
• 公開（公告）號: CN108559730B
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 康文;王博文;孫永濤;左佳蕙;康文臻
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/90
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 倪鉅芳

本發明涉及一種利用CRISPR/Cas9技術構建Hutat2:Fc基因敲入單核細胞的實驗方法，其特征是：包括如下步驟：1)CRISPR/Cas9打靶質粒的構建；2)供體質粒的構建；3)分選原代單核細胞；4)電脈沖穿孔法轉染單核細胞；5)敲入效率的鑒定。本發明方法具有簡便易行，無需后期細胞篩選，即可獲得較高的基因編輯效率，這大大增加了實驗的可行性和應用前景。適用范圍廣等特點。

技術領域

本發明涉及一種實驗方法，具體是一種利用CRISPR/Cas9技術構建Hutat2:Fc基因敲入單核細胞的實驗方法。屬于醫學領域。

背景技術

近年來，獲得性免疫缺陷病毒(HIV)的感染率逐年升高。抗病毒藥物的發現和普及，使得HIV感染已經由一種急性致死性疾病逐漸變為一種慢性可控性疾病。隨著患者生存時間的延長，HIV感染并發癥發病率逐年提高，其中HIV相關神經認知紊亂受到廣泛關注。HIV相關神經認知紊亂在HIV感染者中的發病率為40％-60％，大大的影響著患者的生存質量。

經研究發現，HIV轉錄激活因子(HIV-Tat)在HIV相關神經認知紊亂的發生發展中扮演著重要角色：一方面，HIV-Tat本身作為一種神經毒性因子可以直接損傷神經元和膠質細胞，另一方面，HIV-Tat可以激活HIV的轉錄和復制，促進HIV在神經系統中的擴散。因此，中和HIV-Tat對于HIV相關神經紊亂的治療中具有重要意義。

由于血腦屏障的存在，普通的抗病毒藥物無法到達中樞神經系統發揮藥物作用，因此找到合適的穿越血腦屏障的方法不僅具有科學研究意義，也具有實際應用價值。常用的穿越血腦屏障的方法有以下幾種：受體或載體介導的胞吞機制，電磁場、超聲波等瞬時開放侵襲性手段以及細胞介導的跨越血腦屏障機制。其中，胞吞機制的實施對藥物要求高，操作難度大，而且藥物持續時間短；侵襲性手段的實施局部損傷大，患者耐受性差，這些方法實用價值較低。

在中樞神經系統細胞治療方面單核細胞具有明顯的優勢。但是單核細胞體外增值和表達能力較差，目前還沒有一種行之有效的針對單核細胞的基因編輯技術，從而大大限制了單核細胞在中樞神經系統治療中的應用。

目前傳統的基因編輯方法，慢病毒/腺病毒介導的細胞感染技術，脂質體介導的細胞轉染技術以及ZFN/TALEN介導的基因定點插入技術。病毒介導的轉染技術具有明顯的生物安全問題，且其造成的基因隨機整合可能影響基因組的穩定性；脂質體介導的細胞轉染技術治療性基因無法長期穩定表達；ZFN/TALEN介導的基因定點插入技術操作難度大，編輯效率低。如何將人源化的抗HIV-Tat抗體-Fc融合蛋白Hutat2:Fc敲入單核細胞，以期達到治療目的是目前要解決的問題。

發明內容

本發明的目的利用CRISPR/Cas9技術構建Hutat2:Fc基因敲入單核細胞的實驗方法。本發明方法具有簡便易行，無需后期細胞篩選，即可獲得較高的基因編輯效率，這大大增加了實驗的可行性和應用前景。適用范圍廣等特點。

本發明的目的是通過以下措施來實現的：利用CRISPR/Cas9技術構建Hutat2:Fc基因敲入單核細胞的實驗方法，其特征是：包括如下步驟：

1)CRISPR/Cas9打靶質粒的構建；

2)供體質粒的構建；

3)分選原代單核細胞；

4)電脈沖穿孔法轉染單核細胞；

5)敲入效率的鑒定。

所述步驟1)CRISPR/Cas9打靶質粒的構建；具體如下：

a)篩選得到針對人體基因組AAVS1位點的靶序列為SEQ ID No.1：GGGGCCACTAGGGACAGGATTGG；