[發明專利]一種印第安納沙門氏菌PCR檢測試劑盒及其非診斷性檢測方法

有效

• 申請號: 201810026204.0
• 申請日: 2018-01-11
• 公開（公告）號: CN107988405B
• 公開（公告）日: 2020-02-18
• 發明（設計）人: 龔建森;張萍;張笛;樂敏;沈海玉;莊林林;許明;徐敬瀟;盛中偉;韓先干;竇新紅
• 申請（專利權）人: 江蘇省家禽科學研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/10;C12R1/42
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙) 11548
• 代理人: 黃玉玨

本發明公開了一種印第安納沙門氏菌PCR檢測試劑盒及其非診斷性檢測方法。所述試劑盒包括10×PCR緩沖液、2.5U/μl Taq DNA聚合酶、10mM dNTPs、印第安納沙門氏菌特異性PCR檢測引物、陽性對照和陰性對照，所述陽性對照物為印第安納沙門氏菌ATCC51959基因組DNA；所述陰性對照為滅菌雙蒸水。本發明還公開了一種應用所述試劑盒檢測印第安納沙門氏菌的PCR方法。本發明方法具有快速、簡單、特異性強、靈敏度高的優點，無需沙門氏菌診斷血清即可檢測印第安納沙門氏菌，相比傳統的沙門氏菌血清學分型方法，在檢測時間與檢測成本方面具有較大優勢，適合于批量檢測。

技術領域

本發明屬于分子生物學檢測技術領域，涉及一種印第安納沙門氏菌PCR檢測試劑盒及其非診斷性檢測方法。

背景技術

印第安納沙門氏菌(Salmonella Indiana)最早于1955年分離自美國印第安納州患嘔吐、腹瀉和發燒的女孩，其后該病原在北美和歐洲等地又引發了多起人與哺乳動物感染的疫情。在我國，印第安納沙門氏菌早年的報道較少，但近年來在包括人、動物、食品和環境等不同來源中均具有較高的流行率，已成為僅次于腸炎沙門氏菌的流行血清型，超越了其它幾種常見血清型(鼠傷寒沙門氏菌、德爾卑沙門氏菌、阿貢納沙門氏菌等)。諸多研究表明，印第安納沙門氏菌與人畜的嘔吐、腹瀉、發燒、胃腸炎、局部感染等病癥密切相關。目前，印第安納沙門氏菌在我國的廣泛流行，已引起畜禽養殖、食品安全、公共衛生等領域的高度關注。

國內外對于印第安納沙門氏菌的檢測標準都是基于傳統培養結合血清學分型的方法(如GB/T 4789.4-2008，SN 0170-92，AOAC 967.25-967.28，ISO 6579:2002/Amd 1:2007等)，由于上述方法包括前處理、預增菌、選擇性增菌、選擇性培養、生化鑒定和血清學測試等，過程繁瑣且費時，不能達到及時發現病原、控制傳播途經，消除污染源的疫病防控要求。隨著科技的發展，以分子生物學為基礎的病原檢測方法在實踐檢驗中不斷取得新進展，成為取代傳統檢測方法最具潛力的檢測方法之一，其中PCR方法以其敏感、特異、簡便、快速的特點成為在分子生物學水平建立的重要檢測技術之一。

經對現有技術的文獻檢索發現，尚未發現與本發明的印第安納沙門氏菌血清型PCR檢測方法及試劑盒的報道。

發明內容

本發明針對傳統技術在沙門氏菌檢測分型中存在的不足，特別是如何提高檢測效率、靈敏度與特異性，提供了一種特異性檢測印第安納沙門氏菌的PCR試劑盒及其非診斷性檢測方法。

本發明技術方案如下：

本發明提供了一種特異性檢測印第安納沙門氏菌的PCR試劑盒及其非診斷性檢測方法，所述印第安納沙門氏菌的PCR試劑盒包括10×PCR緩沖液、2.5U/μl Taq DNA聚合酶、10mM dNTPs、PCR檢測引物、陽性對照和陰性對照，所述陽性對照物為印第安納沙門菌ATCC51959基因組DNA，所述陰性對照為滅菌雙蒸水。

進一步的，所述PCR試劑盒檢測體系的組分為：每25μl反應液中包括10×PCR緩沖液2.5μl、dNTPs 2μl、Taq DNA聚合酶0.25μl、上游引物1μl、下游引物1μl、DNA模板1μl以及適量的滅菌雙蒸水。

進一步的，所述印第安納沙門氏菌PCR檢測方法的反應流程為：94℃預變性3min；94℃變性30s；55℃退火30s；72℃延伸25s；共30個循環，最后72℃延伸10min。

進一步的，所述10×PCR緩沖液含有100mM KCl、80mM(NH₄)SO₄、pH為9.0的100mMTris-HCl、15mM MgCl₂和0.5％Tergitol-type NP-40。

進一步的，所述印第安納沙門氏菌PCR檢測方法的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。