[發明專利]一種從馬氏珠母貝基因組中高通量開發SNP位點和InDel的方法

在審

• 申請號: 201810023010.5
• 申請日: 2018-01-10
• 公開（公告）號: CN108103177A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發明（設計）人: 王忠良
• 申請（專利權）人: 廣東海洋大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 劉瑤云;陳偉斌

1.一種從馬氏珠母貝基因組中高通量開發SNP位點和InDel的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1. 提取待測馬氏珠母貝品系的基因組DNA；

S2. 片段化基因組DNA；

S3. DNA片段末端修復、磷酸化并加腺嘌呤尾巴；

S4. 將步驟S3的產物連接接頭并篩選300～400 bp片段；

S5. PCR文庫富集及純化；

S6. 上機測序；

S7. 測序數據分析。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1中，使用CTAB法提取基因組DNA。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S2中，使用雙鏈片段化酶片段化基因組DNA。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S2中，所述片段化的反應體系為：基因組DNA 5ng～3μg、Reaction Buffer 2μL、雙鏈片段化酶 0.12μL，加雙蒸水至18μL體系；反應條件為：37 ℃，15h。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S3中，所述DNA片段末端修復、磷酸化并加腺嘌呤尾巴的反應體系為：End Prep Enzyme Mix 3μL、End Repair ReactionBuffer6.5μL、上一步反應產物55.5μL；反應條件為：20 ℃，30 s；65 ℃，30 s。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S4中，所述連接接頭反應體系和條件為：上一步反應產物60μL、Blunt/TA Ligase Master Mix 15μL、NEBNext Adaptor forIllumina 2.5μL、Ligation Enhancer 1μL，總體積83.5μL，20℃反應15min；再加入3μLUSER enzyme，37℃反應15min。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S4中，使用磁珠法篩選300～400 bp片段。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S5中，文庫富集及純化反應體系為：上一步反應產物 23μL、NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix μL 25，Index Primer1μL，Universal PCR Primer 1μL。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S5中，文庫富集及純化反應條件為：98℃ 30s；98℃ 10s，65℃ 75s，72℃ 30s，6～15 循環；72℃，5min。

10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S6中，上機測序使用Hiseq X10PE150。