[發明專利]用于快速繁殖過表達VEGF的血管內皮祖細胞的組合物

有效

• 申請號: 201810022140.7
• 申請日: 2018-01-10
• 公開（公告）號: CN108424879B
• 公開（公告）日: 2019-04-02
• 發明（設計）人: 朱思品;徐家科;吳琨;徐麗婉
• 申請（專利權）人: 暨賽再生醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/071;C07K14/475
• 代理公司: 廣州勝沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 孫文卉

本發明提供了一種用于快速繁殖過表達VEGF的血管內皮祖細胞的組合物，包括內皮細胞基礎培養基和添加成分，其中內皮細胞基礎培養基可為EGM?2培養基、M199和DMEM中的一種；添加成分包括胎牛血清、成纖維生長因子、維生素C、表皮細胞生長因子、L?谷氨酰胺、全反式視黃酸和倍他米松。在培養過表達VEGF的血管內皮祖細胞時，通過使用本發明的組合物，可保持血管內皮祖細胞的內皮細胞的特性，快速增殖細胞，提高VEGF的表達量。

技術領域

本發明涉及細胞培養領域，具體涉及一種用于快速繁殖過表達VEGF的血管內皮祖細胞的組合物。

背景技術

由于創傷、感染、腫瘤等原因造成的各種類型骨缺損是臨床上遇到的常見問題。近年來，骨組織工程技術的逐漸興起為骨缺損的修復提供了有效的解決策略，早期研究證明，用組織工程骨修復小段骨缺損時，其早期成骨及后期骨愈合效果明顯。但在應用大塊組織工程骨修復大段骨缺損時，其核心部位往往發生缺血壞死，導致修復失敗，其主要原因就在于未能很好的解決組織工程骨的血管化問題，血管化問題現已成為制約組織工程骨應用于臨床的瓶頸。對各種促血管生長因子的研究是目前組織工程骨血管化研究的熱點之一。

“血管發生”是新生血管形成的主要機制之一，其主要發生于胚胎期，通過內皮前體細胞分化成內皮細胞，在中胚層，內皮細胞分化、增殖、遷移、連接并形成原始毛細血管叢，此過程受血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)控制。VEGF 是強有力的血管直接誘導因子，是一類具有肝素結合性的二聚糖蛋白，具有誘導血管內皮細胞增殖、促進血管生成、增加毛細血管滲透性等作用，使血管內成分滲漏，為血管內皮細胞遷移及血管形成提供基質，同時抑制血管內皮細胞凋亡，誘導血管平滑肌細胞遷移，促進血管平滑肌細胞合成和分泌基質金屬蛋白酶，并加速基質降解及炎癥趨化等，最終促使新生毛細血管形成。VEGF家族包括VEGF A、B、C、D和胎盤形成因子，其中VEGF A 是研究較集中的因子，具有四種異構體，分別由121、165、189、206個氨基酸組成，其中 VEGF-165活性最強，分布范圍廣，是體內發揮作用的主要形式。然而重組VEGF-165蛋白價格昂貴，在體內會很快被血液、組織液稀釋，半衰期短，很難在局部達到持續的有效作用濃度，而且局部大量應用副作用嚴重，易導致局部血管瘤。

血管內皮祖細胞(Endothelial Progenitor Cell，EPC)最早由Asahara等于1997年報道，它是一群具有游走特性，尚未表達成熟血管內皮細胞表型，能分化為血管內皮細胞直接參與血管形成。它在骨髓、臍帶血及外周血中均存在,并能在出生后的血管新生過程中有很強的促血管生成作用，并以血管發生方式形成新生血管。多數學者認為，CD34、CD133、FLK-1 三種細胞表面分子同時陽性的細胞才是EPC，它能靶向于缺血或血栓部位，促進并參與新生血管的形成，在血管疾病、生物工程材料等諸多領域有廣泛的研究應用前景。這一發現，更新了傳統意義上的出生后血管生成、血管損傷修復的理論，也為解決組織工程骨血管化問題提供了新的思路。然而由于EPC的細胞數量有限，獲取困難，體外培養時需要擴增，培養周期長，且需要經FN介導貼壁生長才有利于其存活，這些不足限制了其在動物實驗及臨床研究中的應用。

近年來，隨著基因工程技術的發展，基因治療已成為廣大學者研究的熱點，轉基因的組織工程技術為血管化提供了新的思路和方法。VEGF基因修飾EPC可彌補其數量不足的缺點，VEGF基因轉染可明顯增強EPC的新生血管特性，能大大優化EPC的促血管新生效果。She等報道應用VEGF-165基因轉染的EPC能明顯促進缺血心肌中血管新生，從而明顯改善大鼠急性心肌梗死后的心功能。易成剛等用人臍血中EPC，利用VEGF-165基因體外轉染后移植于裸鼠隨意皮瓣，可促進缺血皮瓣的血管新生，提高皮瓣的存活率，而轉染VEGF-165 基因的EPC具有更強大的促血管新生的作用。

在EPC的培養過程中，培養基的選擇十分重要，中國專利申請CN 106754650 A公開了目前的培養基主要有以下幾種：

M199+10％FBS+VEGF+bFGF+CSF；