[發明專利]一種含有能夠降解4-氨基喹啉功能基因的質粒

有效

• 申請號: 201810020978.2
• 申請日: 2018-01-10
• 公開（公告）號: CN107988220B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 豆俊峰;曹巍;王營營;朱宜;丁愛中;云影
• 申請（專利權）人: 北京師范大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種含有能夠降解4-氨基喹啉功能基因的質粒，其特征在于，該質粒由菌株微桿菌Microbacterium sp.M.CWS5的菌液經過提取與純化得到的；提取與純化含有降解4-氨基喹啉功能基因的質粒所用的菌株微桿菌Microbacterium sp.M.CWS5在2017年10月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，該中心位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC No.14840；從菌株微桿菌Microbacterium sp.M.CWS5中提取與純化含有降解4-氨基喹啉功能基因的質粒的具體方案為：

(1)向體積為500mL的錐形瓶內加入400mL基礎培養基、1.0mL微量金屬液、0.1mL質量濃度為10mg/L的維生素c溶液，搖勻后作為液體培養基備用；其中基礎培養基的組成為：NH₄NO₃:1.7g·L^-1，KH₂PO₄:1.0g·L^-1，K_.2HPO₄:1.0g·L^-1，MgCl₂:0.30g·L^-1，CaCl₂·2H₂O:0.15g·L^-1；微量金屬液的組成為：CoCl₂·6H₂O:55mg·L^-1，CuCl₂:0.35mg·L^-1，H₃BO₃:11.0mg·L^-1，MnCl₂·4H₂O:45mg·L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O:5.5mg·L^-1，NiCl₂·2H₂O:4.5mg·L^-1，ZnCl₂:4.5mg·L^-1；

(2)在超凈工作臺中向體積為100mL的錐形瓶中加入4.0mL質量濃度為0.5g/L的4-氨基喹啉丙酮溶液，為除去丙酮將錐形瓶開口放置2天；

(3)向由步驟(2)得到的錐形瓶內加入40mL按步驟(1)配制的液體培養基；

(4)在超凈工作臺中挑取菌株微桿菌Microbacterium sp.M.CWS5，將其接種至由步驟(3)得到的錐形瓶中，然后在溫度為25～30℃、轉速為100r/min的振蕩器中培養20～22天，得到菌液A；

(5)將步驟(4)得到的菌液A轉移到離心管中，在10000r/min條件下離心10min，棄去上清液，得到菌體B；

(6)將10mL pH值為9.0濃度為0.10M的NaH₂PO₄緩沖液加入到菌體B中，旋渦振蕩5min后再進行超聲波振蕩15min，在10000r/min條件下離心10min，棄去上清液，得到菌體C；

(7)將35mL濃度為0.48M的三羥基甲基氨基甲烷溶液，15mL濃度為0.23M的EDTA溶液和15mL濃度為0.78M的KCl溶液加入到10mL質量百分比濃度為3.0％的氯化十六烷基三甲胺溶液中，搖勻后得到混合液A；

(8)將步驟(6)得到的菌體C和2.5毫克N-乙酰胞壁質聚糖水解酶加入到12mL混合液A中，在0～4℃條件下振蕩10min，然后加入1.5mL質量濃度為50g/L的乙氧基化烷基硫酸鈉溶液，旋渦振蕩5min后在55℃條件下水浴振蕩1h，在10000r/min條件下離心10min，收集上清液，得到混合液B；

(9)將15mL濃度為5.5M的醋酸鉀和25mL甲基叔丁基醚加入到15mL異丙醇中，搖勻后得到混合液C；

(10)將混合液B加入到8mL混合液C中，在0～4℃條件下振蕩15min，在10000r/min條件下離心10min，收集上清液，得到混合液D；

(11)將混合液D加入到離心純化柱上，將離心純化柱放入到離心管中，在10000r/min條件下離心10min，倒去離心管中的液體；重復這一過程，直至所有混合液D都經過離心純化柱純化；

(12)將5mL濃度為4.8M的鹽酸胍、8mL濃度為4.5M的醋酸鉀和2毫升2,3-二氟苯甲醇加入到85mL無水乙醇中，搖勻后得到混合液E；

(13)將0.8mL混合液E加入到經步驟(11)處理后得到的離心純化柱中，在0～4℃條件下振蕩15min，將離心純化柱放入到離心管中，在10000r/min條件下離心10min，倒去離心管中的液體；

(14)將4mL濃度為15mM的三羥基甲基氨基甲烷溶液和3mL濃度為3.5M的NaCl溶液加入到8mL濃度為2.5mM的EDTA溶液中，搖勻后得到混合液F；

(13)將0.8mL混合液F加入到經步驟(13)處理后得到的離心純化柱中，在55℃條件下振蕩20min，在10000r/min條件下離心5min，離心管中得到的液體即為含有降解4-氨基喹啉功能基因的質粒溶液，在-20℃保存備用。