[發明專利]一種提高大腸桿菌生長性能的方法

在審

• 申請號: 201810020498.6
• 申請日: 2018-01-10
• 公開（公告）號: CN108060174A
• 公開（公告）日: 2018-05-22
• 發明（設計）人: 王天文;靳會巧;劉紫薇;李一萌;羅欣琪;袁紅雨
• 申請（專利權）人: 信陽師范學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N15/31;C12R1/19
• 代理公司: 南京業騰知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32321
• 代理人: 鄭婷

本發明公開一種提高大腸桿菌生長性能的方法，包括以下步驟：以植物乳酸菌的基因組DNA為模板，用PCR方法擴增rpoD的編碼序列；然后，分別對PCR產物和質粒pET28a用Ncol和HindIII進行雙酶切，并對雙酶切后的PCR產物進行清潔處理，對雙酶切后的質粒進行割膠回收純化，用T4 DNA連接酶進行連接，將重組質粒再轉化到大腸桿菌菌株中，獲得可表達RpoD轉錄因子的重組菌株。本發明通過向大腸桿菌中引入可調控其轉錄的轉錄因子基因，促進大腸桿菌的生長性能，使該大腸桿菌菌株在生長上表現出優勢，這對于基于此菌株進行的生物技術研究，具有重要意義。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種提高大腸桿菌生長性能的方法。

背景技術

大腸桿菌具有生長快，遺傳操作相對簡單，可利用成本較低的基質進行大規模發酵。因此，它是生產中制備多種生物技術產品的宿主，使基因工程中的模式菌株，也是目前應用最為廣泛的外源蛋白原核表達系統。此系統可作為“細胞工廠”而生產多種生物技術產品。但是，它還有許多可以改善的方面，比如其生長性能可以進一步提高，對不良環境(如代謝產生的乙酸造成的酸脅迫)的抵抗力也有待增強。因此，對其進行有效基因工程改造并提高大腸桿菌的生長性能，已成為更好地利用大腸桿菌進行生物產品制造時所需解決的一個重要問題。

轉錄因子是一種具有特殊結構、能調控基因表達的功能性蛋白質分子。它控制著基因是否被轉錄，以及轉錄的強度。有的轉錄因子，通過有效識別啟動子，啟動基因的表達，并且這種調控是廣域的，而有些轉錄因子，則具有很強的針對性，只對部分基因的表達起調控作用。而細胞作為整體的功能發揮，是一個細胞內所有基因在轉錄因子調控下形成的復雜的基因表達網絡相互作用的結果。如果一個轉錄因子是廣域的，那么受該轉錄因子調控的基因數目可能很大。因此，這個轉錄因子也將對細胞的多種功能產生影響。這意味著，通過調節廣域轉錄因子，有望實現對細胞整體性能的改善。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺點和不足，提供一種提高大腸桿菌生長性能的方法。

為實現以上目的，本發明公開以下技術方案：一種提高大腸桿菌生長性能的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將植物乳桿菌(Lactobacillus planttarum WSFC)基因組DNA作為模板，根據轉錄因子rpoD的序列，設計引物rpoDf,rpoDr的序列(在rpoDf加入NcoI酶切位點，在rpoDr加入HindIII酶切位點)，再用PCR方法擴增rpoD的編碼序列；

(2)對PCR產物和質粒pET28a分別用NcoI和HindIII進行雙酶切處理，再對其分別進行割膠回收純化和PCR片段清潔處理，用T4-DNA連接酶進行連接，完成重組質粒PTE28a-rpoD的構建；

(3)將重組質粒導入到大腸桿菌中。

作為一種優選方案，步驟(4)中采用熱激轉化法將重組質粒導入到大腸桿菌BL21(DE3)中進行培養實驗和生長性能測定。

作為一種優選方案，構建pET28a-rpoD設計的引物如下：

上游引物rpoDf:CATGCCATGGAAATGGCAAAGGCAAAAGCAA

下游引物rpoDr:CCCAAGCTTTTATTCCAAGAAATCTTTTAACTGTTTACTACGT

作為一種優選方案，步驟(1)中擴增rpoD基因的循環條件94℃-3min，(94℃-20s，60℃-15s，72℃-1min10s)共30個循環，72℃-3min。

作為一種優選方案，步驟(1)中進行雙酶切時將雙酶切體系混合均勻后，將其置于200μl的PCR薄壁管中，懸于燒杯中，使其不與燒杯的壁接觸，并置于在家用微波爐(頻率為2450MHz，功率為800W)以“中高”檔加熱50s。