[發(fā)明專利]基于CRISPR靶向基因組修飾技術(shù)建立熒光素酶knock-in細(xì)胞系的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810020095.1
• 申請(qǐng)日: 2018-01-09
• 公開（公告）號(hào): CN108559760A
• 公開（公告）日: 2018-09-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏海濱;李子航;趙俊麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 陜西師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/90;C12N5/10
• 代理公司: 西安恒泰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 61216
• 代理人: 李鄭建

本發(fā)明涉及一種基于CRISPR靶向基因組修飾技術(shù)建立熒光素酶knock?in細(xì)胞系的方法，采用CRISPR/Cas9技術(shù)在基因組上SREBP1基因的3’端原位整合入T2A?Luciferase報(bào)告基因，建立了SREBP1?T2A?Luciferase的knock?in細(xì)胞系，并驗(yàn)證了此細(xì)胞系中外源基因在基因組上的定點(diǎn)整合。同時(shí)利用已報(bào)道的對(duì)SREBP1有激活作用的轉(zhuǎn)錄因子LXRα對(duì)SREBP1?T2A?Luciferase細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活，結(jié)果表明SREBP1?T2A?Luciferase細(xì)胞系內(nèi)的Luciferase表達(dá)水平可以準(zhǔn)確靈敏地反映細(xì)胞系內(nèi)SREBP1分子表達(dá)水平。該細(xì)胞系的建立將有助于SREBP1基因功能研究及篩選影響SREBP1表達(dá)的小分子化學(xué)藥物，為脂代謝及其相關(guān)研究提供一種新的實(shí)驗(yàn)思路及解決方案。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的靶向基因組插入技術(shù)建立細(xì)胞系，具體涉及一種基于CRISPR/Cas9靶向基因組修飾技術(shù)建立KI-T2A-Luciferase細(xì)胞系的新方法。

背景技術(shù)

CRISPR/Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌長期演化形成的免疫防御系統(tǒng)，該系統(tǒng)是利用CRISPR-derivedRNA(crRNA)通過堿基配對(duì)與trans-activating RNA結(jié)合形成復(fù)合物，Cas9內(nèi)切酶在此復(fù)合物引導(dǎo)下對(duì)與crRNA配對(duì)的序列進(jìn)行定點(diǎn)切割。所以，通過人工設(shè)計(jì)具有引導(dǎo)作用的sgRNA(short guide RNA)，可以引導(dǎo)Cas9對(duì)宿主細(xì)胞DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割，然后通過非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)或同源重組(homologousrecombination，HR)兩種修復(fù)途徑的機(jī)制進(jìn)行修復(fù)，實(shí)現(xiàn)基因編輯。

目前檢測基因的表達(dá)調(diào)控主要是通過RT-PCR、Western Blot和將目標(biāo)基因啟動(dòng)子克隆到攜帶報(bào)告基因的表達(dá)檢測載體中等手段來實(shí)現(xiàn)。RT-PCR過程繁瑣且不穩(wěn)定，WesternBlot抗體標(biāo)記費(fèi)時(shí)昂貴，這些都不利于高通量篩選；由于基因組本身存在表觀遺傳學(xué)修飾，將啟動(dòng)子克隆到攜帶報(bào)告基因的表達(dá)檢測載體中的方法無法模擬基因組的真實(shí)狀態(tài)，因此難以準(zhǔn)確反映基因組上基因表達(dá)情況。

隨著今年來報(bào)告基因技術(shù)的不斷發(fā)展，熒光蛋白報(bào)告基因、熒光素酶報(bào)告基因等已成為基礎(chǔ)研究中常用的細(xì)胞標(biāo)記與示蹤的方法，由于其具有方便快捷、安全直觀的優(yōu)點(diǎn)，不僅普遍應(yīng)用于探索構(gòu)建分子通路的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，而且越來越廣泛用于篩選藥物所構(gòu)建的細(xì)胞系。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于，利用CRISPR/Cas9技術(shù)，提供一種基于CRISPR/Cas9靶向基因組修飾技術(shù)建立KI-T2A-Luciferase細(xì)胞系的新方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案：

一種基于CRISPR/Cas9靶向基因組修飾技術(shù)建立KI-T2A-Luciferase細(xì)胞系的方法，其特征在于，按下列步驟實(shí)施：

1)在目的基因SREBP1的終止密碼子下游設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的sgRNA，室溫退火后連入pU6-sgRNA1.0，篩選后獲得sgRNA表達(dá)組件，并檢測其打靶效率；

2)將檢測過的打靶效率高的sgRNA表達(dá)組件與Cas9基因克隆至一個(gè)表達(dá)載體，獲得pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA；

3)構(gòu)建靶向SREBP1基因的打靶載體pUC19/SREBP1-donor，該打靶載體pUC19/SREBP1-donor的結(jié)構(gòu)為兩部分，第一部分是與斷裂位點(diǎn)上下游分別具有相同序列的上下游同源臂；第二部分是位于上下游同源臂之間的待重組入基因組靶位點(diǎn)的T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA DNA片段；