[發明專利]一種利用微生物轉化山奈酚生產紫云英苷的方法

有效

• 申請號: 201810018169.8
• 申請日: 2018-01-09
• 公開（公告）號: CN107964556B
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發明（設計）人: 陳乃東;谷仿麗;戴軍;劉東;宋向文;臧永軍;朱富成;王芳;姜雪萍;鮑玲玲;陳艷君;鄭詮;陳乃富
• 申請（專利權）人: 皖西學院
• 主分類號: C12P19/60
• 分類號: C12P19/60;C12N1/14;C07H17/07;C07H1/06;C12R1/645
• 代理公司: 合肥市浩智運專利代理事務所(普通合伙) 34124
• 代理人: 王志興

1.一種利用微生物轉化山奈酚生產紫云英苷的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)選取藍色犁頭霉菌，菌種活化后，制成種子液轉接到液體馬鈴薯培養基中擴大培養；培養期間，于發酵液中加入山奈酚；所述藍色犁頭霉菌的拉丁名稱為：Absidiacoerulea，于中國工業微生物菌種保藏管理中心保藏，菌株保藏編號為：CICC 40302；

(2)加入山奈酚后的第2-4天向發酵液中添加8-12％葡萄糖或13-17％蔗糖作為轉化促進劑以轉化發酵液，再繼續震蕩培養；

(3)加入山奈酚后的第5-8天，取出發酵液并提取分離紫云英苷，得轉化總提物；

(4)將上述步驟獲得的轉化總提物通過硅膠柱層析分離、葡聚糖凝膠純化，最終獲得目標產物-紫云英苷。

2.根據權利要求1所述的利用微生物轉化山奈酚生產紫云英苷的方法，其特征在于，所述步驟(1)中菌種的活化方法為：將藍色犁頭霉菌菌株接種于固體馬鈴薯培養基平板上，置于恒溫箱中，23-26℃培養1-2d，得活化的藍色犁頭霉菌菌株。

3.根據權利要求1所述的利用微生物轉化山奈酚生產紫云英苷的方法，其特征在于，所述步驟(1)中藍色犁頭霉菌種子液的制備方法為：將活化后的藍色犁頭霉菌菌株在無菌條件下以接種環挑取菌絲接種于液體馬鈴薯培養基中培養，計數，以濃度為(2-4)×10⁸CFU/mL的菌液作為種子液。

4.根據權利要求1所述的利用微生物轉化山奈酚生產紫云英苷的方法，其特征在于，所述步驟(1)中種子液轉接到液體馬鈴薯培養基中擴大培養的具體方法為：取種子液接種至30-60倍體積的液體馬鈴薯培養基中，24-26℃恒溫震蕩培養22-26h，再將山奈酚溶于丙酮成飽和溶液，按丙酮含量3-5％加入發酵液。

5.根據權利要求1所述的利用微生物轉化山奈酚生產紫云英苷的方法，其特征在于，所述步驟(3)中發酵液中紫云英苷的具體提取分離方法為：加入山奈酚后的第5-8天，取出發酵液，18-22kHz超聲處理8-12min后，以等體積乙酸乙酯萃取2-4次，合并萃取液，于48-52℃減壓濃縮，獲得轉化總提物。

6.根據權利要求1所述的利用微生物轉化山奈酚生產紫云英苷的方法，其特征在于，所述步驟(4)中硅膠柱層析分離的具體方法為：

a.15-30倍轉化總提物質量的柱層層析硅膠作為分離硅膠，干法裝柱；

b.將轉化總提物溶于甲醇，加入1-3倍總提物質量的柱層層析硅膠作為拌樣硅膠，攪拌均勻后揮干溶劑，干法上樣；

c.乙酸乙酯-甲醇系統梯度洗脫，收集10:1洗脫部位。

7.根據權利要求6所述的利用微生物轉化山奈酚生產紫云英苷的方法，其特征在于，所述柱層層析硅膠為200-300目硅膠，在使用前先于100-110℃烘箱中活化1-3h。

8.根據權利要求1所述的利用微生物轉化山奈酚生產紫云英苷的方法，其特征在于，所述步驟(4)中葡聚糖凝膠純化的具體方法為：所獲樣品溶于甲醇，葡聚糖凝膠柱氯仿-甲醇＝1:1為洗脫劑純化。