[發明專利]一種DNA甲基化檢測試劑盒及其使用方法

在審

• 申請號: 201810012042.5
• 申請日: 2018-01-05
• 公開（公告）號: CN108018336A
• 公開（公告）日: 2018-05-11
• 發明（設計）人: 張春陽;王黎娟;王子月
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 王志坤

1.一種DNA甲基化檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括亞硫酸氫鈉、對苯二酚、脫鹽柱、0.3摩爾每升的氫氧化鈉、醋酸銨、乙醇、三氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀、氯化鎂、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、聚乙二醇辛基苯基醚、探針X、探針Y、探針X′、探針Y′、核酸外切酶I、核酸外切酶III、10×NEBufferI、硫酸銨、Cy5標記的報告探針、生物素標記的捕獲探針、熱穩定連接酶和605量子點。

2.根據權利要求1所述DNA甲基化檢測試劑盒，其特征在于，所述探針X、探針Y、探針X′和探針Y′的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。

3.根據權利要求2所述DNA甲基化檢測試劑盒，其特征在于，探針Y在5′末端修飾磷酸基團，3′末端進行修飾磷硫酰化，探針Y′在5’末端進行磷酸基團修飾。

4.根據權利要求1所述DNA甲基化檢測試劑盒，其特征在于，所述Cy5標記的報告探針為：5′-TGA CTC TGT GGA GTC CTG CC-3′，如SEQ ID NO.5所示，其中3’端第四個堿基T堿基上修飾Cy5熒光分子；生物素標記的捕獲探針為：

5′-CGA GAC TAG TCA GTA-3′，如SEQ ID NO.6所示，3′末端修飾生物素分子。

5.根據權利要求1-4任一所述DNA甲基化檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，分為以下步驟：

(1)DNA亞硫酸氫鹽處理，將待測DNA在42℃、0.35摩爾每升的氫氧化鈉條件下變性30分鐘后，進行亞硫酸氫鈉反應，反應后利用脫鹽柱進行DNA回收，用0.3摩爾每升的氫氧化鈉在37攝氏度反應15分鐘完成修飾，然后用醋酸銨中和、乙醇沉淀和干燥，將DNA溶液超純水中20℃保存、備用；

(2)三步循環連接酶鏈式反應；

(3)核酸外切酶I和核酸外切酶III處理：在三步循環連接酶鏈式反應(LCR)結束后，在37℃條件下，50單位核酸外切酶I，50單位核酸外切酶III，

10×NEBufferI加入到反應混合物來消化探針X、X′、Y′和X′Y′30分鐘，消化反應在90℃孵育10分鐘以終止反應，將XY產品存儲在4攝氏度；

(4)雜交反應：Cy5標記的報告探針、生物素標記的捕獲探針和XY產品在緩沖溶液體系中室溫下孵育20分鐘獲得三明治雜交產物；雜交反應后三明治產物通過生物素-鏈酶親和素相互作用組裝到605量子點表面來形成605量子點-寡核苷酸-Cy5納米結構。

6.根據權利要求5所述DNA甲基化檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，步驟(1)亞硫酸氫鈉反應方法為：將變性后的待測DNA加入到新鮮制備的3.2摩爾每升的亞硫酸氫鈉和0.5毫摩爾每升對苯二酚混合液中50℃反應16～18小時。

7.根據權利要求5所述DNA甲基化檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，步驟(2)三步循環連接酶鏈式反應，反應體系為：20毫摩爾每升pH值為8.3的三氨基甲烷鹽酸鹽、25毫摩爾每升的氯化鉀、10毫摩爾每升的氯化鎂、0.5毫摩爾每升的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、0.01％聚乙二醇辛基苯基醚、1微摩爾每升的探針X、1微摩爾每升的探針Y、1微摩爾每升的探針X′、1微摩爾每升的Y′探針和待測DNA，反應體系總體積為20微升；反應條件為：將上述反應體系95℃加熱變性3分鐘，然后在75℃加入2單位熱穩定連接酶，緊接著在95℃反應1分鐘后，然后在46攝氏度連接反應，在1分鐘內熱循環30次。

8.根據權利要求5所述DNA甲基化檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，步驟(4)緩沖溶液體系包含100毫摩爾每升三氨基甲烷鹽酸鹽、10毫摩爾每升硫酸銨和3毫摩爾每升氯化鎂，緩沖液pH值為8.0。

9.根據權利要求1-4任一所述DNA甲基化檢測試劑盒的應用，其特征在于，所述試劑盒可用于在胞嘧啶/鳥嘌呤二核苷酸和非胞嘧啶/鳥嘌呤二核苷酸位點進行DNA甲基化的檢測。