[發明專利]一種基因敲除載體及其斑馬魚膠質瘤模型

在審

• 申請號: 201810011807.3
• 申請日: 2018-01-05
• 公開（公告）號: CN107988246A
• 公開（公告）日: 2018-05-04
• 發明（設計）人: 楊小駿;羅娟娟
• 申請（專利權）人: 汕頭大學醫學院
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/65;C12N15/90;A01K67/027;A01K67/02
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙)31219
• 代理人: 周建軍

1.一種基因敲除載體，其特征在于，所述基因敲除載體為將目的序列連入可表達CRISPR-Cas9基因編輯系統相關酶的質粒獲得，所述目的序列選自如下序列中的至少一種：

rb1:TGCATGGAGAATATGGGAGA；

nf1:GGCGCACAAGCCCGTGGAAT；

tp53:TGATTGTGAGGATGGGCCTG。。

2.根據權利要求1所述的基因敲除載體，其特征在于：所述可表達CRISPR-Cas9基因編輯系統相關酶的質粒為Cas9-pXT7質粒；

和/或，所述基因敲除載體還含有標記基因mCherry。

3.根據權利要求1所述的基因敲除載體，其特征在于：所述基因敲除載體還含有GFAP啟動子啟動的CAS9蛋白序列、融合蛋白P2A序列、標記基因mCherry、U6啟動子啟動的gRNA。

4.根據權利要求3所述的基因敲除載體，其特征在于：所述基因敲除載體序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根據權利要求1-4任一項所述基因敲除載體在構建膠質瘤動物模型中的用途。

6.根據權利要求5所述的用途，其特征在于：所述動物模型包括魚、鼠、兔，優選為斑馬魚。

7.一種建立斑馬魚膠質瘤模型的方法，包括如下步驟：

1)確立p53、Rb1和Nf1基因打靶位點以及打靶序列，合成gRNA；

p53、Rb1和Nf1基因含有如下目標序列：

rb1:TGCATGGAGAATATGGGAGA；

nf1:GGCGCACAAGCCCGTGGAAT；

tp53:TGATTGTGAGGATGGGCCTG；

2)構建基因敲除轉座重組載體；

3)將基因敲除轉座重組載體和Tol2mRNA共同注射入斑馬魚單細胞期受精卵中，實現目的基因整合進入基因組；

4)篩選并鑒定出能夠穩定敲除上述三種基因的純種斑馬魚；

5)篩選出雙基因或多基因敲除的純系斑馬魚。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：步驟2)中，所述重組載體包括GFAP啟動子啟動的CAS9蛋白序列、融合蛋白P2A序列、標記基因mCherry、U6啟動子啟動的gRNA；

和/或，所述重組載體序列如SEQ ID NO.1所示；

和/或，步驟2)中所構建的重組載體Cas9的啟動子為GFAP，序列如SEQ ID NO.2所示；

和/或，步驟2)中所構建的重組載體的篩選基因為紅色熒光蛋白mCherry，序列如SEQ ID NO.3所示；

和/或，步驟2)中所構建的重組載體靶位點的啟動子為U6啟動子，序列如SEQ ID NO.4所示。

9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：步驟4)中，獲得單敲斑馬魚純合體F3的步驟如下：選擇生殖細胞中表達紅色熒光的嵌合體F0代，培養至成魚，剪尾T7E1檢測基因敲除情況，將基因被敲除的F0代和野生型斑馬魚進行雜交，后代中如果仍然有熒光且基因被敲除的個體，屬于雜合體F1，將雜合體F1的單個個體與野生型斑馬魚再次進行雜交，后代中仍然有熒光且基因被敲除的個體為雜合體F2，將雜合體F2中的雌魚和雄魚進行雜交，在雜交得到的后代中，篩選得到GFAP啟動子啟動特定熒光蛋白表達且組織特異性基因敲除的斑馬魚的純合體F3，運用T7E1檢測獲得純合敲除基因型斑馬魚。

10.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：步驟5)中，將單基因敲除的純合斑馬魚進行兩兩雜交，獲得雙基因敲除的純合斑馬魚，再將雙基因敲除的斑馬魚與另一單基因敲除的純合斑馬魚雜交，獲得多基因敲除的斑馬魚膠質瘤模型。