[發明專利]一種斑節對蝦A1426G單核苷酸多態性標記候選序列的篩選方法

在審

• 申請號: 201810011659.5
• 申請日: 2018-01-05
• 公開（公告）號: CN108504743A
• 公開（公告）日: 2018-09-07
• 發明（設計）人: 鐘聲平;王賢豐;趙艷飛;宋志飛
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區海洋研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6858
• 代理公司: 北海市佳旺專利代理事務所(普通合伙) 45115
• 代理人: 黃建中

本發明公開的是一種斑節對蝦單核苷酸多態性標記候選序列的篩選方法，包括以下步驟：（1）篩選候選序列：（2）篩選候選SNP位點：（3）采用PAMSA方法來設計的A1426G_SNP位點引物序列。本發明可以在沒有已知的斑節對蝦基因組DNA單核苷酸多態性位點的信息下，通過轉錄組混合樣測序，篩選出候選序列及候選SNP位點，為斑節對蝦A1426G單核苷酸多態性標記的篩選及檢測打下基礎，在這基礎上利用生物信息學分析篩選A1426G單核苷酸多態性位點，并采用PAMSA（PCR amplification of multiple specific alleles）方法設計特異性引物，不僅可便捷的通過聚丙酰胺凝膠電泳完成斑節對蝦A1426G單核苷酸多態性檢測、驗證及基因分型，而且篩選檢測費用低、操作簡便快速。

技術領域

本發明屬于斑節對蝦DNA分子遺傳標記技術，涉及的是一種斑節對蝦A1426G單核苷酸多態性標記候選序列的篩選方法。

背景技術

斑節對蝦(Penaeus monodon)是對蝦屬種形體最大的物種，俗稱鬼蝦、草蝦和九節蝦，廣泛分布于印度、太平洋等沿岸海域，在我國主要分布在南方的福建省、廣東省、廣西壯族自治區和海南省等沿岸海域。斑節對蝦生長快、個體大、肉味鮮美并且營養豐富，產量高，是我國南方養殖蝦類主要品種之一。目前我國斑節對蝦自然種群由于過度捕撈、病害感染及棲息地被破壞等原因，其種質資源量逐年下降，種群數量越來越少，已經很少能形成漁汛了。并且，養殖生產所需的苗種親本主要來源于海南海域捕獲的野生雌蝦，進一步導致其自然資源逐漸衰退。對斑節對蝦自然優良種質進行生態保護已經迫在眉睫。在此基礎上進行種質創新，大力推廣良種選育是恢復其種質資源，推進其產業健康可持續發展的重要措施。種質資源評估和家系系譜鑒定需要大量的DNA分子標記來提高可靠性。Jerry等人曾開展過斑節對蝦譜系鑒定工作，因為微衛星標記擴增效率、無效等位基因和影子帶等因素導致從23對微衛星標記中僅篩選出7對標記(30％)用于系譜鑒定^[2]。可見篩選足夠數量DNA分子標記是斑節對蝦開展種質鑒定的前提保障。然而，與大西洋鮭魚等海水養殖魚類相比，目前斑節對蝦分子標記開發的數量和質量尚不能滿足系譜鑒定、遺傳連鎖圖譜等研究的需求。

作為新一代的DNA分子標記，單核苷酸多態性標記是基因組中含量最豐富的分子標記，并且遺傳穩定性高、分型準確，易于實現高通量、自動化的檢測，是當前斑節對蝦選育群體遺傳背景調查、個體選育、家系系譜鑒定和高密度遺傳連鎖圖譜構建的首選DNA分子標記之一。但斑節基因組DNA信息匱乏，有關其單核苷酸多態性標記開發、應用的研究少有報道。Matthew Baranski等人報道了斑節對蝦(Penaeus monodon)的SNP標記篩選，所采用的檢測分型方法是基因芯片分型，該方法標記篩選、驗證及應用的成本較高，而斑節對蝦(Penaeus monodon)的SNP標記篩選的檢測分型的過程中，最關鍵的是斑節對蝦單核苷酸多態性標記候選序列的篩選方法和候選SNP位點篩選方法，篩選出了多態性標記候選序列及候選SNP位點，就可以實現對斑節對蝦單核苷酸多態性標記的篩選及檢測，從而實現對斑節對蝦單核苷酸多態性標記驗證及基因分型，有利于斑節蝦系譜鑒定、遺傳連鎖圖譜構建等研究開展。

發明內容

本發明的目的在于提供一種斑節對蝦A1426G單核苷酸多態性標記候選序列的篩選方法,在斑節對蝦基因組DNA信息匱乏的背景下,實現對斑節對蝦單核苷酸多態性標記的篩選及檢測，從而實現對斑節對蝦單核苷酸多態性標記驗證及基因分型，為斑節對蝦育種項目中的遺傳背景調查和家系系譜鑒定服務。

為實現上述目的,本發明采取了下述技術方案,一種斑節對蝦單核苷酸多態性標記候選序列的篩選方法，本發明包括以下具體技術步驟：

(1)篩選候選序列：提取20個斑節對蝦個體的頭胸甲總RNA，混合樣品進行轉錄組測序，拼接斑節對蝦頭胸甲參考轉錄本，比對定位測序讀端(reads)到參考轉錄本篩查單核苷酸多態性位點，并篩選比對質量分數大于40、次要等位基因頻數在200以上，及次要等位基因頻率高于20％的位點為候選序列；