[發明專利]一種鑒別水稻稻瘟病廣譜抗性基因Bsr-d1的分子標記方法

在審

• 申請號: 201810011617.1
• 申請日: 2018-01-05
• 公開（公告）號: CN108165648A
• 公開（公告）日: 2018-06-15
• 發明（設計）人: 張斯梅;許揚;趙婕宇;顧克軍;王軍;張傳輝;顧東祥;許博
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

1.一種鑒別水稻稻瘟病廣譜抗性基因Bsr-d1的分子標記方法，其特征在于，所用特異性分子標記引物CAPs5-1序列為：

正向引物CAPs5-1-F序列為5'-AGTCTAGCATCCACCGTTCCAC-3'

反向引物CAPs5-1-R序列為5'-GTAGGCAGGCAGTGGGATGA-3'。

2.根據權利要求1所述的一種鑒別水稻稻瘟病廣譜抗性基因Bsr-d1的分子標記方法，其特征在于，用權利要求1所述Bsr-d1基因特異性引物CAPs5-1擴增水稻植株的基因組DNA，擴增產物經過限制性內切酶酶切，如果能夠切成99bp、214bp的特征條帶即為含Bsr-d1基因的純合體；如果不能夠酶切，只含有313bp的特征條帶即為不含Bsr-d1基因的純合體；如果同時存在99bp、214bp和313bp的三條特征條帶，則為Bsr-d1基因的雜合體。

3.根據權利要求1或2所述的一種鑒別水稻稻瘟病廣譜抗性基因Bsr-d1的分子標記方法，其特征在于，20μL PCR反應體系包括：10×PCR Buffer(Mg²⁺)2.0mL，dNTP(10mmol/L)0.5μL，5U/μL的Taq酶0.2μL，10pmol/L的正向引物1.0μL，10pmol/L的反向引物1.0μL，DNA2.0μL，ddH₂O 13.3μL。

PCR反應條件包括：94℃預變性5min,然后94℃變性1min、58℃退火1min、72℃延伸1.5min,32個循環,最后72℃延伸10min,10℃冷卻10min后，將擴增產物加上樣緩沖液終止反應；反應結束后擴增產物加入指示劑，將擴增產物在1.5％瓊脂糖上進行電泳，DuRed染色，紫外凝膠成相系統保存圖像；

4.根據權利要求1或2所述的一種鑒別水稻稻瘟病廣譜抗性基因Bsr-d1的分子標記方法，其特征在于，對CAPs5-1擴增的PCR產物進行AIUⅠ酶切，酶切反應體系為10μL，分別為PCR反應產物5μL，10×Buffer R 1μL，AIUⅠ(10U/μL)0.1μL，ddH₂O 3.9μL，混勻后再在37℃恒溫水浴鍋酶切5-8h，酶切產物在1.5％瓊脂糖上進行電泳，DuRed染色，經紫外凝膠成相系統成像。

5.根據權利要求3所述的一種鑒別水稻稻瘟病廣譜抗性基因Bsr-d1的分子標記方法，其特征在于，對CAPs5-1擴增的PCR產物進行AIUⅠ酶切，酶切反應體系為10μL，分別為PCR反應產物5μL，10×Buffer R 1μL，AIUⅠ(10U/μL)0.1μL，ddH₂O 3.9μL，混勻后再在37℃恒溫水浴鍋酶切5-8h，酶切產物在1.5％瓊脂糖上進行電泳，DuRed染色，經紫外凝膠成相系統成像。