[發明專利]一種對蝦虹彩病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201810011276.8
• 申請日: 2018-01-05
• 公開（公告）號: CN108018379A
• 公開（公告）日: 2018-05-11
• 發明（設計）人: 周俊芳;程家驊;房文紅;姜亞洲;李新蒼;李楠英;趙姝;王元;馬清揚
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院東海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達;魏峯

本發明涉及一種對蝦虹彩病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包括特異性引物：IVQF：CAATCATGTTGTTGTATCCATCCTTCT；IVQR：GGTTTCATTCAACGTAAACGATCTCG。本發明基于實時熒光定量PCR方法，適用于對蝦虹彩病毒病暴發風險的準確評估；檢測靈敏性比常規PCR方法大幅提高，適用于對蝦虹彩病毒隱性感染的早期監測。本發明具有良好的穩定性以及組內重復性，相對于探針法成本更低、操作更為簡便，因此，具有良好的應用與推廣前景。

技術領域

本發明屬于對蝦虹彩病毒疾病檢測領域，特別涉及一種對蝦虹彩病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒。

背景技術

虹彩病毒屬于虹彩病毒科，是一種二十面體對稱的胞漿型、雙鏈DNA病毒。該科可分5個屬，即蛙病毒屬(Ranavirus)、淋巴囊腫病毒屬(Lymphocystivirus)、細胞腫大病毒屬(Megalocytivirus)、虹彩病毒屬(Iridovirus)和綠虹彩病毒屬(Chloriridovirus)。因此，宿主范圍非常廣泛，能夠感染魚類、兩棲類和無脊椎動物，其中，虹彩病毒屬和綠虹彩病毒屬主要感染無脊椎動物。

對蝦是我國重要的水產養殖經濟品種，日本囊對蝦和中國對蝦還是我國重要的增殖漁業對象。然而，近兩年調查研究發現，我國養殖日本囊對蝦、中國對蝦和凡納濱對蝦均存在對蝦虹彩病毒感染，其中，養殖日本囊對蝦和凡納濱對蝦的虹彩病毒感染率均在10％以上，流行地區野生日本囊對蝦的虹彩病毒感染率更是高達50％以上，預示著很高的養殖和放流風險。

常規的病毒檢測技術如組織病理、免疫組化等具有周期長、損傷大、不能一次確診等缺點，而聚合酶鏈式反應(PCR)技術具有快速、靈敏和組織樣品需要量極小的特點，特別適用于對育苗親蝦的篩選(損傷小)和對放流蝦苗的病原監測。與常規PCR相比，實時熒光定量PCR技術具有靈敏度更高和可量化的特性，不僅能夠大幅提高病原檢出率，還能對疾病暴發的風險程度進行準確評估，從而大幅提升疾病防控策略的精準性。建立對蝦虹彩病毒實時熒光定量PCR技術，可實現對對蝦虹彩病毒病的早期預警和精準防控，為對蝦的健康養殖和增殖放流等提供技術支撐。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種對蝦虹彩病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒，該試劑盒比常規PCR方法具有更高的檢測靈敏性，大幅提高了病毒微量感染樣品的檢出率，因此，適用于對蝦虹彩病毒隱性感染的早期監測以及對蝦虹彩病毒病暴發風險的準確評估。

本發明提供了一種對蝦虹彩病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包括特異性引物：

IVQF：5'-CAATCATGTTGTTGTATCCATCCTTCT-3'；

IVQR：5'-GGTTTCATTCAACGTAAACGATCTCG-3'。

所述試劑盒的PCR反應體系為：總體積20μl，其中，Hot start DNApolymerase(5U/μl)0.12μl，10×Hot start DNA polymerase buffer(Mg2+20mM)2.4μl，dNTPs(各2.5mM)1.6μl，引物IVQF(10μM)0.6μl，引物IVQR(10μM)0.6μl，DNA模板2μl，1×SYBR Green I 1.6μl，無DNA酶水11.08μl；最后添加ROX Reference Dye 0.4μl。

所述試劑盒的PCR反應條件為：95℃30s預變性；然后95℃5s，60℃20s，循環40次。