[發明專利]受磷蛋白基因反義RNA重組AAV載體、病毒、構建方法及應用

在審

• 申請號: 201810004671.3
• 申請日: 2018-01-03
• 公開（公告）號: CN108192922A
• 公開（公告）日: 2018-06-22
• 發明（設計）人: 李江;胡申江
• 申請（專利權）人: 李江
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N15/66;C12N7/01;A61K48/00
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 韓曉娟

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種受磷蛋白基因反義RNA重組AAV載體、病毒、構建方法及應用。所述受磷蛋白基因反義RNA重組AAV載體是分別將如SEQ ID NO.1所示的PLB基因片段和腺相關病毒骨架質粒pAAV?MCS分別經EcoRI和BamHI雙酶切后，將PLB基因片段和腺相關病毒骨架質粒pAAV?MCS的酶切產物連接而成的。所述重組腺相關病毒由受磷蛋白基因反義RNA重組AAV載體和輔助質粒共轉染工程細胞后包裝而成。本發明制備的重組腺相關病毒載體克服了非病毒載體的低轉染效率，制備的rAAV?asPLB也克服了重組腺病毒的免疫原性、表達時間短等缺點，具有高轉染效率、安全和持久表達等優勢。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種受磷蛋白基因反義RNA重組AAV載體、病毒、構建方法及應用。

背景技術

隨著人類基因組計劃的開展和分子生物學研究的逐步深入，眾多疾病的分子機制的闡明和致病基因不斷發現，基因治療已經從單基因遺傳性疾病的治療發展到多基因常見多發病的治療，尤其在心腦血管疾病及各種腫瘤的治療中展現出良好應用前景。基因治療中的三個關鍵問題為：1、人類疾病病因和致病機理的進一步明確，尤其是從分子機制角度來研究并提出有效的基因治療方案。2、基因治療及相應的治療策略的優化和合理配伍，以提高整體上對疾病的治療效果。3、安全、高效、穩定的基因表達系統即理想的載體的構建和應用。據此，合理的基因治療方案必須具備三個要素：目的基因、靶細胞以及基因傳遞的方法。選擇合適的靶基因、合適的載體以及合適的治療策略是基因治療研究中的熱點和難點。

心臟收縮和舒張障礙的一個主要原因是由于心肌細胞的興奮－收縮偶聯的異常。鈣離子(Calcium，Ca²⁺)是心肌興奮－收縮偶聯的關鍵因子，在胞漿鈣濃度的調節中，肌漿網Ca²⁺-ATPase發揮主要作用，而其功能主要由受磷蛋白(磷酸受納蛋白，磷酸蘭苯，phospholamban,PLB)的調節。心肌收縮時心肌細胞內Ca²⁺離子濃度會明顯影響心肌細胞的收縮能力，增加Ca²⁺濃度會產生心肌的正性肌力作用。

心肌細胞的收縮時肌漿內質網Ca²⁺離子釋放通道開放，使Ca²⁺由肌漿內質網進入胞漿中，而舒張時肌漿內質網上的Ca²⁺-ATPase將鈣重新攝取。心肌細胞肌漿網Ca²⁺-ATPase活性影響了細胞對鈣的調控，而肌漿網Ca²⁺-ATPase的活性受PLB的調節。在非磷酸化狀態下，PLB抑制肌漿網Ca²⁺-ATPase；cAMP依賴性蛋白激酶和鈣調蛋白依賴性蛋白激酶則使PLB磷酸化而活化肌漿網Ca²⁺-ATPase。減少PLB的表達可以減少對肌漿網Ca²⁺-ATPase的抑制作用，從而增加心肌的收縮和舒張，改善心功能。采用PLB的反義核酸或其突變體的高表達可提高肌漿網Ca²⁺-ATPase的活性。在擴張性心肌病鼠模型中，敲除該基因可成功預防心功能異常。最近的研究中發現在轉基因模型中，隨著靶點PLB的剔除，嚴重心力衰竭的發展會完全停止。對PLB基因的深入研究，有望為心功能障礙、鈣調節異常等疾病的基因治療提供新的靶基因。

基因治療是將基因轉移到體細胞以治療和預防疾病的治療方法。基因治療的策略主要有以下幾種：①基因替換：用正常功能基因替代原有突變的異?；颍虎诨蚣m正：用外源正?；蚋淖兓蛲蛔兊娜笔Р糠?，并保持基因的正常功能；③基因增強：導入外源正?；?，調節原有基因表達水平的不足；④基因抑制：轉入反義核酸，抑制變異的表達。