[發明專利]干擾長鏈非編碼RNA PVT1表達的試劑在制備鼻咽癌放療增敏劑中的應用

有效

• 申請號: 201810003157.8
• 申請日: 2018-01-02
• 公開（公告）號: CN108559744B
• 公開（公告）日: 2020-04-21
• 發明（設計）人: 熊煒;曾朝陽;李桂源;何奕;郭燦;熊芳;魏芳;唐艷艷;楊麗婷;王裕民;龔朝建;張姍姍
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/70;C12N15/66;A61K31/713;A61P35/00
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所(普通合伙) 43114
• 代理人: 袁靖

本發明公開了一種干擾長鏈非編碼RNA PVT1表達的試劑在制備鼻咽癌放療增敏劑中的應用。通過在鼻咽癌細胞系CNE2和5?8F中導入靶向PVT1的干擾載體(siPVT1)抑制PVT1的表達后，細胞分別接受0，2，4，6，8Gy劑量的放射線照射，隨后細胞繼續培養12天，克隆集落形成實驗表明與陰性對照(NC，轉染scramble干擾載體的細胞)相比，抑制PVT1表達后，CNE2和5?8F細胞形成的集落數明顯減少，表明細胞對放射治療更加敏感，表明干擾長鏈非編碼RNA PVT1表達的試劑可以用于制備鼻咽癌放療增敏劑。

技術領域

本發明屬于腫瘤分子生物學領域，具體涉及干擾長鏈非編碼RNA PVT1表達的試劑在制備鼻咽癌放療增敏劑中的應用方法。

背景技術

人類基因組計劃及其后續的DNA元件百科全書計劃(The Encyclopedia of DNAElements Project,ENCODE)研究成果表明，蛋白編碼基因序列僅占人類基因組序列的1-3％，而人基因組中絕大部分可轉錄的序列為長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)。LncRNA廣泛地存在于各種生物中，且隨著生物復雜程度的升高，基因組中lncRNA序列的比例也相應地增大，提示lncRNA在生物進化過程中有重要意義。隨著lncRNA不斷被發現，它們的功能逐漸被詮釋，科學家們發現lncRNA廣泛而活躍地參與到生命活動不同層面的功能調控中，作為一個嶄新的領域，已經成為國際生命科學研究領域新的前沿與熱點。

LncRNA可作為功能蛋白質的信號(signal)、誘導(guide)、誘餌(decoy)或支架(scaffold)分子等多種方式，在染色質重構、基因轉錄、翻譯及蛋白修飾等多重水平調控基因的表達，并在包括發育、免疫、生殖等基本生理過程中扮演了不可替代的角色，更重要的是，lncRNA的表達與功能失調已經與包括惡性腫瘤在內的人類多種疾病緊密聯系在了一起。因此，深入研究lncRNA的功能，揭示由lncRNA介導的遺傳信息傳遞方式和表達調控網絡，不僅可以從蛋白編碼基因以外的角度重新注釋和闡明基因組的結構與功能，深入發現生命活動的本質和規律，還有望從一個新的視角認識包括腫瘤在內的多種人類常見疾病的發病機理，并為這些疾病的診斷與治療提供新的分子標志物與治療靶點。

鼻咽癌是常見高發的頭頸部惡性腫瘤，容易發生頸部淋巴結轉移，預后較差，放射治療是目前鼻咽癌臨床上主要的治療方案，部分鼻咽癌患者由于癌細胞存在放射抵抗(Radioresistance)，也就是對放射治療不敏感，放射線不能完全殺死腫瘤細胞，殘存的腫瘤細胞最終復發，轉移，導致患者的死亡。研究表明，這種腫瘤的發生發展是多基因參與、多步驟、多階段的復雜過程，LncRNA在鼻咽癌的發生發展過程中可能也起到了重要的作用，同時lncRNA也可能參與了鼻咽癌細胞反射敏感性的調控。最近我們利用lncRNA芯片，構建了鼻咽癌活檢組織及正常對照樣品中lncRNA的表達譜，從中篩選了一些在鼻咽癌中差異表達的lncRNAs，經擴大樣本實時熒光定量PCR驗證，證實lncRNA PVT1在鼻咽癌中表達顯著上調，表明針對該lncRNA的檢測制劑可以用于鼻咽癌的輔助診斷。隨后，我們進一步增加樣本，在94例有臨床隨訪資料的鼻咽癌石蠟存檔標本中，通過原位雜交(in situhybridization)的方法檢測了PVT1的表達水平，發現PVT1表達高的患者更容易發生放療抵抗，其生存時間短于該lncRNA表達低的患者，因此針對該lncRNA的檢測制劑也可以用于鼻咽癌的療效預測和預后判斷。

我們通過設計并合成靶向PVT1的短發夾RNA(short-hairpin RNA,shRNAs)序列，構建了靶向PVT1的RNA干擾載體，轉染到鼻咽癌細胞株中，并證實了靶向干擾PVT1的表達可明顯增強鼻咽癌細胞的放療敏感性。將PVT1的RNA干擾載體負載到多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒上制成納米基因轉運體，多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒可保護PVT1的RNA干擾載體免受核酸酶降解，延長作用時間，且有更高的轉染效率。因此針對該lncRNA的干擾制劑靶向抑制該lncRNA在鼻咽癌細胞中的表達可以誘導鼻咽癌細胞對放療更加敏感，從而可以作為新型放療增敏劑，用于鼻咽癌的輔助治療。