[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)EML4-ALK、ROS1和RET融合基因突變的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810001999.X
• 申請(qǐng)日: 2018-01-02
• 公開（公告）號(hào): CN108103175B
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡春旭;陸思嘉;任軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 序康醫(yī)療科技（蘇州）有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種通過文庫(kù)構(gòu)建并測(cè)序一次性檢測(cè)EML4?ALK，ROS1和RET融合基因突變的方法。本發(fā)明能在3小時(shí)內(nèi),由1?2000個(gè)新鮮組織細(xì)胞，10pg?20ng經(jīng)提取的總RNA，或血漿游離RNA為起始，在ALK,ROS1,RET特異性引物與逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下對(duì)其中包含融合型信息的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并獲得cDNA第一鏈，而后以模板轉(zhuǎn)換技術(shù)在cDNA的3’端添加一段接頭序列(帶有分子標(biāo)簽)并進(jìn)行cDNA二鏈生成，而后以接頭區(qū)段為引物錨定位點(diǎn)進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增的同時(shí)在cDNA兩端加上Illumina文庫(kù)接頭，以獲得符合下游分析要求的高質(zhì)量cDNA文庫(kù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種用于一次性檢測(cè)EML4-ALK、ROS1和RET融合基因突變的方法，所述方法包括構(gòu)建文庫(kù)并測(cè)序。

背景技術(shù)

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率居各癌癥之首。每年全世界有超過130萬(wàn)的患者死于肺癌，近一半發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。據(jù)2010年我國(guó)衛(wèi)生部的統(tǒng)計(jì)，肺癌死亡率為30.83/10萬(wàn)，肺癌已經(jīng)成為發(fā)病率和死亡率第一位的惡性腫瘤(Orras JM,Fernandez E,Gonzalez JR,et al.Lung cancer mortality in European regions(1955-1997).Ann Oncol,2003,14(1):159_161；中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，《2010年中國(guó)衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)》年鑒)。

肺癌從組織病理學(xué)上可以分為小細(xì)胞癌(SCLC)和非小細(xì)胞癌(non-small celllung cancer,NSCLC)兩大類，其中非小細(xì)胞癌約占肺癌總病例的85％。在我國(guó)肺癌患者5年的生存率僅為13％，其主要原因是大多數(shù)肺癌由于缺乏高靈敏度的基因突變檢測(cè)和確診技術(shù)，以及與之相匹配科學(xué)的治療方案，從而使患者錯(cuò)失了治療的最佳時(shí)機(jī)。

目前化療仍是肺癌主要治療手段，然而多數(shù)化療會(huì)產(chǎn)生較大的毒副作用，不同患者間的化療效果會(huì)有較大差異。隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，肺癌的分子靶向治療因其特異性高，毒副作用低，日益成為臨床醫(yī)生首選治療方式。

EML4-ALK(Echinodem Microtubule-associated protein-Like 4-AnaplasticLymphoma Kinase)基因融合突變的發(fā)現(xiàn)為NSCLC患者提供了新的治療靶點(diǎn)。EML4(棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白4)與微管形成密切相關(guān)；ALK(間變性淋巴瘤激酶)在腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起著重要的調(diào)節(jié)作用。EML4主要包含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)、疏水EMAP蛋白結(jié)構(gòu)域、色氨酸-天冬氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)；EML4和ALK兩個(gè)基因分別位于人類2號(hào)染色體的p21和P23帶，相隔約12Mb。這兩個(gè)基因片段的倒位融合，即inv(2)(p21p23)能夠使得組織表達(dá)新的EML4-ALK融合蛋白。融合后的EML4啟動(dòng)子位于ALK酪氨酸激酶的上游，從而使融合基因活化，表達(dá)EML4-ALK融合蛋白。通過EML4胞外結(jié)構(gòu)形成的二聚體使ALK受體持續(xù)磷酸化，進(jìn)而激活持續(xù)下游的細(xì)胞信號(hào)通路(Soda M,et al.Nature2007；448:561～6；Martelli MP,et al.Am.J.Pathol.174(2):661_70；Koh Y,et al.J Thorac Oncol 2011；6:905-912.)。

新融合基因R0S1的發(fā)現(xiàn)為肺癌患者提供了新的治療靶點(diǎn)。R0S1是胰島素受體家族的一種受體型酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase),R0S 1融合首先發(fā)現(xiàn)于惡性膠質(zhì)瘤中，其融合突變發(fā)生于6號(hào)染色體q22區(qū)(Birchmeier et al.Proc Natl Acad Sci.87(12):1990；Charest et al.Genes Chromosomes Cancer.37:58,2003)。R0S1融合包含一個(gè)完整的酪氨酸激酶區(qū)域，其融合突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞下游信號(hào)通路的激活，從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，增殖和分化。最新的研究表明ROS1是一種新的腫瘤驅(qū)動(dòng)突變基因，其融合在非小細(xì)胞肺癌中被定為一種新的分子亞型。