[發明專利]檢測一個或多個DNA端部的方法及其用途

在審

• 申請號: 201780095738.2
• 申請日: 2017-08-17
• 公開（公告）號: CN111201327A
• 公開（公告）日: 2020-05-26
• 發明（設計）人: 瑪格達萊娜·科爾頓;米羅斯勞·扎雷布斯基;杰吉·多布魯奇;卡米爾·索拉克齊克
• 申請（專利權）人: 音圖基因公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 北京東方億思知識產權代理有限責任公司 11258
• 代理人: 張琳琳

1.一種檢測生物材料中的一個或多個DNA端部的方法，所述方法包括以下步驟I-III和所述步驟I-III中的每一者的子步驟a-h中的至少一者：

I.制備所述材料

a.將所述生物材料固定和/或透化和/或裂解和/或分離和/或分級和/或固定化，

b.提高一個或多個DNA端部的可及性，

c.封閉所述生物材料中2-6型分子的一個或多個非特異性結合位點，

II.處理一個或多個DNA端部

d.通過以下方式對一個或多個DNA端部進行修飾，進行化學或物理處理，隨后藉由催化手段或非催化手段使1型分子與所述一個或多個DNA端部結合，

e.封閉所述生物材料中2-6型分子的一個或多個非特異性結合位點，

III.識別和檢測所述一個或多個經修飾的DNA端部

f.將來自步驟II的所述生物材料與至少兩種分子：2型分子和3型分子一起孵育，所述至少兩種分子以允許導致滾環擴增(RCA)反應的步驟的方式與所述1型分子結合，

g.通過以下方式檢測一個或多個DNA端部：

i.任選地使合適的4型和/或5型分子與所述2型和3型分子接觸，其中所述4型和/或5型分子與1型寡核苷酸綴合，

ii.加入2型寡核苷酸和連接酶，以允許所述加入的2型寡核苷酸與已經與所述4型和/或5型分子連接的所述1型寡核苷酸雜交，或如果所述2型和3型分子與所述1型寡核苷酸連接的話，則與所述2型和3型分子雜交，以及然后執行所述2型寡核苷酸的DNA連接，

iii.通過以下方式來執行擴增：加入聚合酶和核苷酸溶液以允許進行滾環擴增(RCA)反應，以及加入6型分子以允許所述6型分子與由此獲得的RCA反應產物進行后續雜交，

h.檢測所述6型分子，

其中當執行步驟I的多于一個子步驟a-c時，它們可以以任何次序發生。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述一個或多個DNA端部是包括單鏈斷裂或雙鏈斷裂在內的任何一個或多個DNA斷裂的結果。

3.根據權利要求2所述的方法，其中所述一個或多個DNA斷裂選自單鏈切口、單鏈空位、單個磷酸二酯鍵的單鏈斷裂、雙鏈平端斷裂、雙鏈3'突出斷裂、雙鏈5'突出斷裂、包括其中不存在3'-OH或5'-磷酸DNA端部的那些DNA鏈斷裂在內的DNA鏈斷裂類型。

4.根據權利要求1所述的方法，其中所述一個或多個DNA端部的檢測是原位執行的。

5.根據權利要求1所述的方法，其中所述生物材料是活的。

6.根據權利要求1所述的方法，其中所述生物材料被固定。

7.根據權利要求5或6所述的方法，其中所述生物材料選自包括以下的組：動物、植物、原生動物、細菌細胞、病毒、組織，以及它們的片段和/或組分。

8.根據權利要求5或6所述的方法，其中所述生物材料是由膜包圍的細胞或組織或它們的片段。

9.根據權利要求8所述的方法，其中子步驟c在步驟I中執行。

10.根據權利要求5所述的方法，其中在步驟I的子步驟a之前，執行提高一個或多個DNA端部的可及性的附加步驟。

11.根據權利要求1所述的方法，其中所述生物材料存在于溶液中或存在于多孔表面或固體支持物上。

12.根據權利要求11所述的方法，其中所述固體支持物或多孔表面的類型選自包括以下的組：玻璃、塑料、水凝膠、氣凝膠金屬和陶瓷。