[發(fā)明專利]特異性識別甲基化修飾DNA堿基的TALE RVD及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201780093389.0
• 申請日: 2017-08-04
• 公開（公告）號: CN111278848B
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發(fā)明（設計）人: 魏文勝;伊成器;張媛;郭生杰;朱晨旭;劉璐璐
• 申請（專利權）人: 北京大學;博雅輯因（北京）生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C07K19/00;C12N15/31;C12N15/63;C12Q1/6809
• 代理公司: 北京彩和律師事務所 11688
• 代理人: 張紅春

本發(fā)明提供了對于5mC、5hmC和6mA具有識別偏好和不同結合特性的RVD，以及包含含有上述RVD的TALE重復結構域的分離的DNA結合多肽、融合蛋白、其編碼多核苷酸、包含多核苷酸的載體以及宿主細胞。本發(fā)明還提供上述DNA結合多肽、融合蛋白在甲基化依賴的基因激活、高效基因組編輯、檢測目標基因靶序列中的甲基化堿基以及靶向結合細胞中目標基因中的應用。

本發(fā)明涉及使用DNA結合蛋白對基因進行調節(jié)、編輯和檢測的技術。

背景技術

轉錄激活樣效應因子(transcription?activator-like?effector，TALE)是來自植物致病菌黃單胞菌屬(Xanthomonas)的毒力因子，能夠對真核基因組進行再編程(reprogram)(1，2)。TALE含有DNA結合域，該DNA結合域由可變數(shù)量的串聯(lián)重復單元組成(3)。每個重復包含33-35個氨基酸殘基的共有序列(consensus?sequence)，除了在第12位和第13位具有兩個高度可變的氨基酸(重復可變的雙殘基，repeat-variable?diresidues或RVD)(4，5)。TALE蛋白對DNA的識別由串聯(lián)重復單元介導，串聯(lián)重復單元通過其RVD靶向核苷酸，以序列特異性的方式結合DNA，RVD決定了核苷酸特異性(4，6)。RVDs與DNA堿基形成直接的、序列特異性的接觸通過模塊化的DNA識別特性，TALE可以與功能域，如轉錄激活因子(7，8)、轉錄抑制因子(9，10)或核酸內切酶(11，12)等融合，稱為可編程的基因編輯工具。已有的研究中使用實驗方法和計算方法對RVD-DNA識別密碼進行了部分解碼(4，6)；發(fā)現(xiàn)最常用的四個RVD(NI、NG、HD和NN)分別優(yōu)先結合A、T、C和G/A(4，6)。

除了四種常規(guī)脫氧核糖核苷酸之外，哺乳動物基因組還含有修飾的DNA堿基。例如，5-甲基胞嘧啶(5mC)，它被稱為是第五種DNA堿基，是一種重要的表觀標志物，調節(jié)基因表達(圖1)(15，16)。5mC可以相繼被10-11易位酶(TET)家族蛋白氧化，產生5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)，后二者是胸腺嘧啶DNA糖基化酶的底物，并最終恢復為未修飾的胞嘧啶(17，22)。5hmC組成～1％-10％的修飾的胞嘧啶，并被認為是一種穩(wěn)定的表觀標記；在癌癥中經(jīng)常觀察到5hmC的調節(jié)異常。

除了胞嘧啶上的甲基化修飾以外，另一種常見的DNA甲基化修飾N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenine，6mA)作為DNA的腺嘌呤上的一種共價修飾在原核細胞中發(fā)揮重要作用，參與調節(jié)多種生物途徑，包括作為限制修飾系統(tǒng)(restriction-modification，RM)的一部分抵御外源DNA入侵，在DNA復制、錯配修復、基因轉錄和轉座等過程中起調控作用等(41，47)。而6mA在真核生物中的相關研究比較少，同時對6mA在表觀遺傳中的作用也不十分清楚(46)。

2015年在Cell雜志上的三篇文章報道了在衣藻、線蟲和果蠅等真核生物的基因組中的6mA(42，43，48)。對于衣藻(Chlamydomonas?reinhardtii)中6-甲基胞嘧啶位置的測定，發(fā)現(xiàn)衣藻的大部分基因中都有6mA分布，并且多數(shù)是以ApT雙堿基模式出現(xiàn)；同時6mA在轉錄起始位點富集，與基因活躍表達相關(42)。而在果蠅(Drosophila?melanogaster)和線蟲(Caenorhabditis?elegans)的研究中則發(fā)現(xiàn)6mA很可能在分化和發(fā)育過程中起到重要的調控作用(48)。人們發(fā)現(xiàn)6mA甲基化和去甲基化相關的酶在進化中是保守的，所以6mA很可能在其他真核生物中也有分布(43)。直至2016年，Koziol等人證實了6mA在脊椎動物基因組中的存在，其中包括了非洲爪蟾(Xenopus?laevis)的不同組織以及小鼠與人的組織或細胞系。6mA修飾在脊椎動物中豐度很低，研究發(fā)現(xiàn)與衣藻和果蠅不同，爪蟾與小鼠基因組中的6mA廣泛分布于除外顯子以外的區(qū)域，同時也表現(xiàn)出一定的序列基序規(guī)律，說明6mA修飾在不同真核生物中可能有不同的功能(44)。6mA這種表觀遺傳修飾在高等生物中的分布及其在細胞與個體發(fā)育等過程中的作用和機制還有待深入研究。