[發(fā)明專利]病毒顆粒和病毒樣顆粒的超敏感檢測(cè)

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201780082812.7
• 申請(qǐng)日: 2017-11-09
• 公開（公告）號(hào): CN110168368A
• 公開（公告）日: 2019-08-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: D·威爾伯爾德
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 于利奇研究中心有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/543
• 分類號(hào): G01N33/543;G01N33/569;G01N33/58
• 代理公司: 北京思益華倫專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11418
• 代理人: 趙飛

本發(fā)明涉及一種定量和/或定性測(cè)定病毒顆粒的方法，該病毒顆粒包含至少一個(gè)捕獲分子的結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)探針的結(jié)合位點(diǎn)，本發(fā)明還涉及用于實(shí)施所述方法的試劑盒，以及各種用途。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種定量和/或定性測(cè)定病毒顆粒的方法，所述病毒顆粒包含至少一個(gè)捕獲分子的結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)探針的結(jié)合位點(diǎn)，還涉及用于實(shí)施所述方法的試劑盒，以及各種用途。

背景技術(shù)

病毒被定義為感染性顆粒，其只能在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)繁殖。病毒由核酸(DNA或RNA)、蛋白質(zhì)構(gòu)建，在某些情況下，還包含脂質(zhì)。它們還包括感染細(xì)菌的噬菌體。由于它們都沒有獨(dú)立的復(fù)制能力或自身的新陳代謝機(jī)制，因此根據(jù)流行的觀點(diǎn)，它們不能被歸類為生物體。單個(gè)病毒顆粒由上述核酸和蛋白質(zhì)外殼的基因組組成。有些還有另外的外殼。這種完整的感染性病毒顆粒代表病毒的細(xì)胞外形式，也稱為病毒粒子。由于感染性病毒顆粒很小，根據(jù)物種其大小在15nm和300nm之間，所以迄今為止只知道少數(shù)的直接檢測(cè)方法；大多數(shù)檢測(cè)基于受感染細(xì)胞或受感染生物體的癥狀。當(dāng)病原體(例如病毒顆粒)主動(dòng)或被動(dòng)地在生物體中穿透、保留并隨后繁殖時(shí)，這通常被稱為感染。如果宿主細(xì)胞可以歸類為原核生物，則感染性病毒顆粒被稱為噬菌體。

由于顆粒尺寸小，所以使用電子顯微鏡作為迄今為止僅有的直接檢測(cè)病毒顆粒的方法。這涉及基于其作為顆粒的性質(zhì)來(lái)檢測(cè)病毒。除了合適設(shè)備的高成本之外，電子顯微鏡僅能夠區(qū)分不同的病毒科，但不能確定相應(yīng)的亞種。此外，樣品必須是化學(xué)或物理固定的，結(jié)果是功能蛋白質(zhì)不再可用或表位變性或掩蔽。此外，需要存在大量病毒顆粒。

根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，通過功能性的基于抗體或基于基因組的技術(shù)檢測(cè)病毒或病毒組分，例如，基于PCR的病毒RNA或DNA的增殖以及通過雜交依賴性探針鑒定。

通過利用細(xì)胞病變效應(yīng)的噬斑測(cè)定法檢測(cè)功能性病毒。未登記滅活病毒或非感染性粒子。與病毒顆粒的量相比，基于基因組的技術(shù)更多地用于定量病毒RNA/DNA的量。

在Western印跡法中可以用抗體檢測(cè)病毒蛋白的連續(xù)表位。

在強(qiáng)烈懷疑病毒感染的情況下以及當(dāng)其他檢測(cè)方法未能提供陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，使用PCR技術(shù)。該技術(shù)涉及通過使用病毒特異性引物的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增基因組。在RNA病毒的情況下，需要通過逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)錄成DNA。通過特異性探針雜交或通過擴(kuò)增DNA的非特異性染色和凝膠電泳后的尺寸依賴性鑒定來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增子。

基于PCR的方法必須費(fèi)力地校準(zhǔn)，其不是嚴(yán)格定量的并且非常容易受到污染，這可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)際上，它們確定病毒DNA/RNA的存在，或者有時(shí)甚至僅確定其部分。另外，抑制PCR反應(yīng)的樣品組分可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，在分析樣品之前始終必須對(duì)樣品進(jìn)行純化。

檢測(cè)內(nèi)源性抗病毒抗體的免疫測(cè)定通常只在感染后數(shù)周(診斷缺口)得到陽(yáng)性結(jié)果。ELISA方法通常僅檢測(cè)病毒的亞片段而不是完整顆粒的存在。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供病毒顆粒的超靈敏檢測(cè)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種方法，該方法允許以盡可能少的量檢測(cè)任何樣品中的病毒顆粒和病毒樣顆粒，因此甚至可以在任何樣品中進(jìn)行單獨(dú)檢測(cè)，特別是對(duì)于不可培養(yǎng)的病毒。因此，該方法可以檢測(cè)病毒感染以及任何樣品中的污染。

此外，本發(fā)明的意圖在于不僅可以定性檢測(cè)病毒顆粒，而且還可以定量和表征任何樣品中的病毒顆粒。因此，本發(fā)明的意圖在于首先確保顆粒數(shù)的直接和絕對(duì)定量，其次，確保對(duì)病毒顆粒的精確表征，從而使得分型成為可能。本發(fā)明的意圖在于將該結(jié)果用于治療以及診斷、差異診斷和/或病毒組裝分析。

此外，本發(fā)明的意圖還在于該方法還可確保檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，即宿主-病毒相互作用。

本發(fā)明的意圖在于以幾個(gè)簡(jiǎn)單的步驟直接從任何樣品進(jìn)行檢測(cè)，任何樣品例如體外體液或尸檢或活檢材料、器官以及來(lái)自環(huán)境的樣品，例如水樣品、植物樣品和土壤樣品以及食品。