[發明專利]用于確定頭頸部鱗狀細胞癌的方法

在審

• 申請號: 201780082316.1
• 申請日: 2017-11-03
• 公開（公告）號: CN110168107A
• 公開（公告）日: 2019-08-23
• 發明（設計）人: 盧卡·莫蘭迪;達維德·巴爾托洛梅奧·吉西;阿希爾·塔西塔諾
• 申請（專利權）人: 大學之母博洛尼亞大學
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 劉小立;鄭霞

1.用于檢測和/或預后頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)的方法，所述方法包括以下步驟：

(i)從個體獲得分離的生物樣品；

(ii)從所述樣品純化基因組DNA；

(iii)用亞硫酸氫鹽，優選地亞硫酸氫鈉，處理所述基因組DNA；

(iv)在步驟(iii)之后，通過使用至少一個引物對來擴增所述基因組DNA，所述引物對允許擴增選自以下的至少一個基因的基因組DNA區域的至少一個序列：EPHX3、KIF1A、LRRTM1、FLI1、ITGA4、LINC00599、NTM、PARP15、ZAP70、miR193、miR296、GP1BB、hTERT及其任何組合，所述序列包含至少一個CpG和/或CpG島；

(v)測量落入根據步驟(iv)擴增的并且屬于以下基因集的序列中的至少一個CpG和/或CpG島的甲基化水平：

a)人類TERT和KIF1A；和/或

b)LRRTM1、PARP15、ZAP70、miR193、miR296、hTERT；和/或

c)KIF1A、LRRTM1、ZAP70、miR193、miR296、hTERT；和/或

d)KIF1A、LRRTM1、FLI1、LINC00599、PARP15、ZAP70、miR193、miR296、GP1BB、hTERT；和/或

e)EPHX3、KIF1A、LRRTM1、FLI1、ITGA4、LINC00599、NTM、PARP15、ZAP70、miR193、miR296、GP1BB、hTERT，

其中落入所述集的以下基因：EPHX3、KIF1A、LRRTM1、FLI1、ITGA4、LINC00599、NTM、PARP15、ZAP70、miR193中的至少一個的序列中的所述至少一個CpG和/或CpG島的超甲基化和/或落入所述集的以下基因：miR296、GP1BB、hTERT中的至少一個的序列中的所述至少一個CpG和/或CpG島的低甲基化指示HNSCC陽性樣品，其中所述超甲基化和/或所述低甲基化是與從健康個體分離的樣品中測量的甲基化水平相比來評估的。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述HNSCC是在口、鼻和喉中發展的任何腫瘤，優選地所述HNSCC為口腔鱗狀細胞癌(OSCC)、或OSCC的前體，優選地高度鱗狀上皮內病變(HG-SIL)、或口腔癌前病變(OPML)、或癌變場，其中所述OPML優選地選自：黏膜白斑病、黏膜紅斑病、反吸煙性腭部病變、口腔扁平苔蘚、口腔黏膜下纖維化(SMF)和盤狀紅斑狼瘡。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述生物樣品選自：來自口腔黏膜的刷或DNA口腔拭子、血漿、唾液或包含上皮細胞的任何樣品，優選地來自口腔。

4.根據權利要求1-3中任一項的所述方法，其中經歷步驟(iii)的基因組DNA的量范圍為從50ng至10μg，優選地從250ng至1μg。

5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其中亞硫酸氫鹽處理包括DNA變性步驟和使所述變性的DNA與范圍為從2.3 M至3.6 M的量的亞硫酸氫鹽在范圍為從45℃至60℃，優選地從50℃至55℃的溫度反應至少一小時的步驟。

6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述基因組DNA區域選自：基因的調節區域，優選地基因啟動子、5'UTR、3'UTR、和編碼區域，優選地外顯子和/或內含子和/或岸。

7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其中擴增步驟(iv)包括1)擴增所述基因組DNA區域的所述至少一個序列的第一模板特異性擴增步驟；和2)用于條形碼化模板特異性擴增產物和樣品識別的第二擴增步驟。

8.根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述模板特異性擴增步驟使用多重策略來進行。