[發明專利]包含氧化還原調節蛋白的生物硫醇檢測組合物

在審

• 申請號: 201780082078.4
• 申請日: 2017-11-02
• 公開（公告）號: CN110168367A
• 公開（公告）日: 2019-08-23
• 發明（設計）人: 金英必;李鎮伍;李鎮元;梁允模;金泰昱
• 申請（專利權）人: 漢陽大學校產學協力團
• 主分類號: G01N33/536
• 分類號: G01N33/536;G01N33/68;G01N33/533
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 劉明海;寧濤

本發明涉及包含氧化還原調節蛋白的生物硫醇檢測組合物、使用其檢測生物硫醇的方法，以及用于檢測生物硫醇的生物傳感器/試劑盒。本發明提供了快速測量體液中游離生物硫醇的效果。此外，可以實時檢測體液中總生物硫醇和游離生物硫醇之間的相對含量比及變化，這允許生物硫醇作為疾病的主要指標，通過其可以對各種疾病預測和警告。此外，由于通過生物硫醇的變化可以解釋與主要疾病相關的各種氧化還原應激變化，因此本發明可以在將來為發病機制的調查研究和疾病的診斷提供重要的技術、經濟和社會價值。

技術領域

本發明涉及包含氧化還原調節蛋白的生物硫醇檢測組合物、使用該組合物的生物硫醇檢測方法以及用于檢測生物硫醇的生物傳感器/試劑盒。

背景技術

生物硫醇例如蛋白質中存在的半胱氨酸是不同于硫醇的低分子量(LMW)硫醇，并且在所有生物體(從細菌到人類)中對體內氧化應激的抗性和生理活性的調節起重要作用。這種生物硫醇對氧化還原反應非常敏感，被諸如SOH、SO₂H、SNO或S-S的官能團修飾，并因此用作生物分子活性的調節開關。生物硫醇不僅在細胞中豐富，而且是在諸如血液、尿液、汗液和淚液的主要人體體液中被廣泛檢測到。存在于體液中的生物硫醇包括半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、半胱胺(CA)、γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-GluCys)、半胱氨酰甘氨酸(CysGly)、N-乙酰半胱氨酸(N-AC)、輔酶A(CoA)、輔酶B(CoB)、輔酶M(CoM)、芽孢桿菌硫醇(bacillithiol)(BacT)、放線硫醇(mycothiol)(MyT)、麥角硫因(ErT)和錐蟲硫酮(trypanothione)(TrT)。據報道，這些生物硫醇中的特別是Cys、Hcy和GSH的濃度的體內變化與各種類型的疾病密切相關，并且所有濃度范圍彼此不同[非專利文獻1和2]。在實際血漿中，雖然Hcy、Cys和GSH的總濃度(總氧化和還原量)分別在6至20μM、150至350μM和4至10μM的范圍內，但是由于血漿中的高氧化條件，幾乎所有的Hcy和Cys都以氧化形式存在，因此游離形式以非常少的量存在，例如，在Hcy的情況下約為0.2μM或更小，在Cys的情況下約為10μM或更小。類似地，GSH在細胞中也過量(>5mM)存在，但在血漿中通過γ-谷氨酰轉移酶等快速轉化，因此游離形式僅以2μM或更少的濃度存在。這些生物硫醇的總濃度和游離形式濃度的相對變化主要與包括心血管疾病、神經退行性疾病、癌癥、腎功能障礙、糖尿病以及細菌和病毒感染的重大疾病相關[非專利文獻3至7]。然而，盡管作為疾病的常見生物標志物的這些主要生物硫醇可用作指示物，可以檢測能夠早期檢測生物體異常反應的指示物，但是由于快速的氧化還原過程，沒有有效檢測LMW生物硫醇濃度的方法。因此，迄今為止，LMW生物硫醇不能廣泛使用。

用于測量LMW生物硫醇水平的大多數常規標準分析方法依賴于高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜-質譜(GC-MS)或毛細管電泳(CE)。然而，在這樣的分析方法中，存在技術挑戰，其中必須還原LMW生物硫醇以僅測量總量，因為體液樣品的預處理需要過量時間消耗，和成本問題。雖然多種文獻已經公開了在血液樣品預處理期間通過添加抗氧化劑和金屬離子螯合劑來測量游離LMW生物硫醇[非專利文獻8和9]，但即使在這種環境中，也難以精確測量游離LMW生物硫醇的量，因為對于長的分析時間來說游離LMW生物硫醇的氧化非常快。

作為測量LMW生物硫醇的另一種方法，已經廣泛使用市售的基于抗體的免疫分析試劑盒，但是本文使用的所有抗體均不直接識別游離的LMW生物硫醇，而是識別氧化的生物硫醇與蛋白質(例如，在血液的情況下，為血清白蛋白)結合的形式。因此，存在一個限制，即不能檢測到游離LMW生物硫醇和總LMW生物硫醇的動態變化。