[發(fā)明專利]DNA分子的酵母細(xì)胞提取物輔助構(gòu)建

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201780080412.2
• 申請日: 2017-11-17
• 公開（公告）號: CN110100011A
• 公開（公告）日: 2019-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: D·博安
• 申請（專利權(quán)）人: 諾維信公司
• 主分類號: C12Q1/6813
• 分類號: C12Q1/6813
• 代理公司: 北京尚誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11322
• 代理人: 顧小曼;鄒亮

1.一種將多個雙鏈DNA片段組合成DNA分子的方法，所述方法包括：在單一體外反應(yīng)中將所述多個雙鏈DNA片段與酵母菌株的無細(xì)胞提取物接觸，以將所述多個DNA片段組合成所述DNA分子，其中每個所述DNA片段具有5'末端和3'末端，并且其中當(dāng)一個片段的5'末端與另一個片段的3'末端具有至少15bp同源時，所述DNA片段彼此組裝。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中通過以下方式獲得所述DNA片段：通過用一種或多種限制酶消化染色體DNA；通過PCR擴(kuò)增DNA；通過化學(xué)合成；或其組合。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述DNA片段從單個基因組、兩個或多個基因組、突變DNA或改組DNA中獲得。

4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述DNA片段的來源是基因組DNA、cDNA、半合成DNA、合成DNA或其任何組合。

5.如權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中將所述DNA片段與線性化質(zhì)粒或載體組合以產(chǎn)生DNA文庫。

6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述DNA文庫是突變DNA文庫。

7.如權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述酵母菌株是酵母屬菌株。

8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述酵母屬菌株是釀酒酵母。

9.如權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法，其中當(dāng)一個片段的5'末端與另一個片段的3'末端具有至少15bp、至少20bp、至少30bp、至少40bp、至少50bp、至少100bp、或至少200bp同源時，所述DNA片段彼此組合。

10.如權(quán)利要求1至9任一項所述的方法，其中在不添加一種或多種選自由以下組成的組的外源酶的情況下進(jìn)行所述體外反應(yīng)：外源DNA限制酶、外源DNA修飾酶、外源DNA連接酶和外源DNA聚合酶。

11.如權(quán)利要求1至10任一項所述的方法，其中在將所述DNA片段組裝成DNA分子之前，將同源區(qū)側(cè)翼多達(dá)至少1000bp的非同源序列去除。

12.如權(quán)利要求1至11中任一項所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括：將所得DNA分子轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，并分離包含所述DNA分子的單菌落轉(zhuǎn)化體。

13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌菌株。

14.如權(quán)利要求12或13所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括：從所述單菌落轉(zhuǎn)化體中回收DNA分子。

15.如權(quán)利要求14所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括：將所述回收的DNA分子轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，并選擇轉(zhuǎn)化體。

16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述回收的DNA分子與一個或多個控制序列可操作地連接，所述控制序列指導(dǎo)產(chǎn)生由所述DNA分子編碼的具有目的生物活性的多肽。

17.如權(quán)利要求15或16所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括：在適合產(chǎn)生所述具有目的生物活性的多肽的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體。

18.如權(quán)利要求17所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括：回收所述具有目的生物活性的多肽。