[發明專利]用于體外糖工程化抗體的方法

在審

• 申請號: 201780079057.7
• 申請日: 2017-12-19
• 公開（公告）號: CN110088291A
• 公開（公告）日: 2019-08-02
• 發明（設計）人: R·法爾肯施泰因;H·沃爾克;S·馬利克;M·托曼;M·弗賴赫爾范羅曼;I·格倫特;R·多恩;M·欣加爾
• 申請（專利權）人: 豪夫邁·羅氏有限公司
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C12P21/08;C07K16/00
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 陳迎春;黃革生

1.一種產生(糖基化修飾的)抗體的方法，所述方法包括以下步驟：

-通過將包含抗體的溶液施加到固定的抗體輕鏈親和配體，形成抗體-抗體輕鏈親和配體復合物，其中抗體輕鏈親和配體固定在固相上，

-將前一步驟中形成的復合物與一種或多種酶(和一種或多種活化的糖殘基)孵育，以修飾抗體的糖基化，和

從而產生(糖基化修飾的)抗體。

2.根據權利要求1所述的方法，其在孵育步驟之后包括步驟

-從抗體輕鏈親和配體中回收修飾的抗體。

3.根據權利要求1至2中任一項所述的方法，其按以下順序包括以下步驟

-將包含在N-糖基化位點具有糖基化的抗體的(緩沖)溶液施加到與固相結合的抗體輕鏈親和配體，由此抗體與配體結合(產生配體結合的抗體)，

-任選地用緩沖溶液洗滌固相(不解吸附抗體/不破壞配體抗體復合物)，

-通過以下酶促修飾抗體的N-糖基化位點上的糖基化：

-施加包含第一糖基化修飾酶(和第一活化的糖殘基)的第一(緩沖)溶液足夠的時間，并在適于酶促修飾配體結合的抗體的條件下施加，任選地洗滌修飾的配體結合的抗體，施加包含第二糖基化修飾酶(和第二活化的糖)的第二(緩沖)溶液足夠的時間，并在適于酶促修飾經修飾的配體結合的抗體的條件下施加，任選地洗滌修飾兩次的配體結合的抗體，或

-施加包含第一糖基化修飾酶(和第一活化的糖)的第一(緩沖)溶液足夠的時間，并在適于至少部分酶促修飾配體結合的抗體的條件下施加，在確定的一段時間后，施加包含第二糖基化修飾酶(和第二活化的糖)的第二(緩沖)溶液足夠的時間，并在適于酶促修飾經修飾的配體結合的抗體的條件下施加，任選地洗滌修飾兩次的配體結合的抗體，或

-施加包含第一和第二糖基化修飾酶(和第一和第二活化的糖)的(緩沖)溶液足夠的時間，并在適于酶促修飾配體結合的抗體的條件下施加，任選地洗滌修飾的配體結合的抗體，

-從抗體輕鏈親和配體釋放抗體，和

從而產生(糖基化修飾的)抗體。

4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中抗體選自全長抗體、二價單特異性抗體、雙特異性抗體、二價雙特異性抗體、三價雙特異性抗體、四價雙特異性抗體、三價三特異性抗體、抗體Fab片段和四價四特異性抗體。

5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述抗體是二價或三價或四價雙特異性抗體或Fab片段。

6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述抗體是嵌合或人源化或人抗體。

7.根據權利要求3至6中任一項所述的方法，其中所述第一糖基化修飾酶是半乳糖基轉移酶，并且所述第二糖基化修飾酶是唾液酸轉移酶。

8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中溶液包含色譜純化的抗體，(第一)糖基化修飾酶是GalT1，并且與(第一)糖基化修飾酶的孵育是在37℃或室溫下持續24小時。

9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其中溶液包含色譜純化的抗體，(第二)糖基化修飾酶是ST6，并且與(第二)糖基化修飾酶的孵育是在37℃或室溫下持續24小時。

10.根據權利要求1至9中任一項所述的方法，其中溶液是包含抗體的緩沖、無細胞的培養上清液，第一糖基化修飾酶是GalT1，第二糖基化修飾酶是ST6，其在第一糖基化修飾酶6至24小時后，優選24小時后添加，總孵育時間為在37℃或室溫下24小時至48小時，優選30小時。