[發明專利]多能干細胞測定

有效

• 申請號: 201780071024.8
• 申請日: 2017-11-15
• 公開（公告）號: CN110573607B
• 公開（公告）日: 2023-10-20
• 發明（設計）人: I·斯盧克文;D·黑;D·德里耶
• 申請（專利權）人: 洋薊治療有限公司
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00;C12N5/0735;C12Q1/00;G01N33/48
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所 11494
• 代理人: 封新琴

1.一種用于檢測從多能干細胞(PSC)分化的細胞培養物中殘留的未分化PSC的方法，該方法包括：

在涂覆有層粘連蛋白-521和E-鈣粘蛋白的基底上在包含Rho關聯的含卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)抑制劑的培養基中培養該細胞；

對所培養的細胞中殘留的未分化PSC的標記物的表達進行定量；并且

將在所培養的細胞中的該標記物表達與在包含已知比例的PSC的參比細胞培養物中的標記物表達進行比較，

其中該細胞培養物中的標記物表達低于該參比細胞培養物中的標記物表達表明所培養的細胞中不存在殘留的未分化PSC或者所培養的細胞中殘留的未分化PSC的存在比例低于在該參比細胞培養物中PSC的該已知比例。

2.權利要求1的方法，其中該標記物表達是LIN28、OCT4、SOX2、FOXD3、NANOG、PODXL、REX1、SSEA1、SSEA4、DPPA2或DPPA3表達。

3.權利要求1或權利要求2的方法，其中該ROCK抑制劑是Y27632。

4.權利要求3的方法，其中將該細胞在約10μM Y27632中培養。

5.權利要求1至4中任一項的方法，該方法包括將該細胞在包含該ROCK抑制劑的該培養基中培養約3天。

6.權利要求5的方法，其還包括將該細胞在包含該ROCK抑制劑的該培養基中培養之后，在不包含ROCK抑制劑的培養基中培養約2天。

7.權利要求1至6中任一項的方法，其中通過聚合酶鏈式反應(PCR)對該標記物表達進行定量。

8.權利要求7的方法，其中該PCR是定量實時PCR(qRT-PCR)。

9.權利要求8的方法，其中該qRT-PCR包含由5'→3'序列CGCATGGGGTTCGGCTTCCTGTCC(SEQ ID NO:14)組成的探針、由5'→3'序列CACGGTGCGGGCATCTG(SEQ ID NO:15)組成的引物、和由5'→3'序列CCTTCCATGTGCAGCTTACTC(SEQ ID NO:16)組成的引物。

10.權利要求1至9中任一項的方法，其中將該標記物表達歸一化。

11.權利要求10的方法，其中將該標記物表達歸一化至GAPDH表達。

12.權利要求1至11中任一項的方法，其中該已知比例是0.001％。

13.權利要求1至12中任一項的方法，其中該PSC是iPSC。

14.權利要求1至13中任一項的方法，其中該細胞是MSC。

15.權利要求14的方法，其中將該MSC在E8完全培養基中培養。

16.權利要求1至15中任一項的方法，其還包括將其中殘留的未分化PSC不存在或低于已知比例的該細胞培養物配制成治療組合物。

17.權利要求1至16中任一項的方法，其還包括向受試者給予其中殘留的未分化PSC不存在或低于已知比例的該細胞培養物或該治療組合物。

18.一種用于制造治療組合物的方法，該方法包括將其中當通過權利要求1至15中任一項的方法檢測時殘留的未分化PSC不存在或低于已知比例的細胞培養物配制成用于向受試者治療性給予的組合物。