[發明專利]modRNA的細胞特異性表達

在審

• 申請號: 201780070205.9
• 申請日: 2017-09-18
• 公開（公告）號: CN110177578A
• 公開（公告）日: 2019-08-27
• 發明（設計）人: L·贊吉;A·馬加杜姆
• 申請（專利權）人: 西奈山伊坎醫學院
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;C12N15/11;C12N15/00;A61K38/00
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 陳迎春;黃革生

本文公開了用于細胞特異性轉錄(表達)感興趣蛋白的表達調控系統，例如在成年或新生兒心肌細胞或產生胰島素的β細胞中再激活增殖的細胞周期誘導物。該表達調控系統包含編碼特異性結合靶細胞miR的microRNA識別元件和翻譯抑制蛋白的第一核酸；和包含結合翻譯抑制蛋白的抑制蛋白相互作用基序和編碼感興趣蛋白的基因的第二核酸。當感興趣細胞被該系統的第一和第二核酸共轉染時，感興趣蛋白以細胞特異性方式表達。

相關申請的交叉引用

本申請要求2016年9月16日提交的美國臨時申請號62/395,701的優先權，其內容通過引用并入本申請中。

序列表

本申請包含2016年9月7日創建的序列表；該文件以ASCII格式指定為3710029P_SequenceListing_ST25.txt，大小為11,278字節。該文件通過引用整體并入本申請中。

技術領域

本公開內容一般地涉及使用基于細胞特異性miR推翻基因表達抑制的的細胞特異性轉錄調控系統在體外、離體和體內細胞特異性表達治療性蛋白的平臺。

背景技術

化學修飾的信使RNA(modRNA)是一種治療策略，其使細胞機器能夠在不修飾基因組的情況下產生感興趣基因。因此，modRNA避免了常規基因治療中出現的幾個問題，包括缺乏基因組整合、表達持久性、免疫原性、可擴展性和生產中的困難、需要終身監測腫瘤發生和其他不良臨床結果、以及載體逃逸到體循環以及體內其他部位的長期表達的可能性。

modRNA作為疾病治療具有相當大的潛力。例如，通過modRNA傳遞細胞周期誘導物將觸發糖尿病個體中β細胞的生長或恢復心肌梗塞或心力衰竭后心肌細胞的增殖。通過傳遞編碼神經生長因子的基因的能力可以減輕糖尿病性神經病變。此外，隨著基因組編輯技術的出現，如果以瞬時和細胞特異性方式傳遞，則CRISPR/Cas9或轉錄激活因子樣效應核酸酶(TALEN)轉染將更安全。

然而，可獲得的modRNA的轉染試劑均未提供高水平的基因表達和靶向任何感興趣細胞的能力。例如，常見的體內轉染試劑是體內(SA,Illkirch,France)，其是基于聚合物的試劑，與modRNA復合以形成納米顆粒。然而，體內-jetPEI在體內主要靶向肺組織，與裸modRNA相比顯著降低轉染效力。

因此，需要的是基于modRNA的基因傳遞系統，其在感興趣的細胞中排他性地實現高水平的基因表達。

發明內容

本公開提供了用于細胞特異性轉錄的表達調控平臺，其基于開發阻遏RNA結合蛋白/k-基序相互作用偶聯細胞特異性miR推翻阻遏功能，以細胞特異性方式控制傳遞的modRNA的表達。RNA結合蛋白如古細菌蛋白L7Ae及其真核同源物如L30e識別特殊的RNA基序，扭結-轉角(本文指k-轉角或k-基序)。通過將k-基序并入編碼感興趣基因(GOI)的第一構建體中并且在編碼RNA結合蛋白的第二構建體中包含針對細胞特異性miR的識別元件，當這兩種構建體共轉染到合適的細胞類型中時GOI表達的抑制被推翻。該平臺包含修飾的mRNA。

因此，本公開涉及用于實現感興趣基因(GOI)的modRNA的細胞特異性表達的方法，僅期望該感興趣基因(GOI)在感興趣細胞中表達。在一個方面，本公開描述了用于細胞特異性轉錄的表達調控系統，該系統包含編碼(1)細胞特異性microRNA(miR)識別元件和(2)翻譯抑制蛋白的第一核酸；和編碼(1)抑制蛋白相互作用基序，例如其5'UTR下游結合翻譯抑制蛋白的K-基序，和(2)編碼感興趣蛋白的基因的第二核酸。核酸是modRNA。

通過交換miR識別元件，可以調節細胞特異性，使系統適應其他細胞類型。