[發明專利]一種提高核酸聚合測序質量的方法、反應體系和試劑盒

有效

• 申請號: 201780068192.1
• 申請日: 2017-01-10
• 公開（公告）號: CN109937259B
• 公開（公告）日: 2023-01-13
• 發明（設計）人: 李計廣;馬可心;邱敏;陳奧;徐崇鈞;章文蔚
• 申請（專利權）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 中國貿促會專利商標事務所有限公司 11038
• 代理人: 楊棽

公開了一種提高核酸聚合測序質量的方法、反應體系和試劑盒。本申請的提高核酸聚合測序質量的方法，包括在聚合測序的反應液中加入第二類核苷酸，第二類核苷酸的3’糖羥基具有阻斷修飾但沒有熒光修飾。

技術領域

本申請涉及核酸測序領域，特別是涉及一種提高核酸聚合測序質量的方法、反應體系和試劑盒。

背景技術

核酸聚合測序即邊合成邊測序(縮寫SBS)，是指在SBS過程中(Metzker et.al.,Genome Res 15(12):1767-1776(2005))，加入經過熒光標記的核苷酸能夠幫助識別模板DNA堿基(Prober et.al.,Science 238:336-341(1987))，從而給出DNA序列信息。近年來，與其它測序方法相比，聚合測序以其通量高、價格低而獲得青睞。在這一測序方法中，通過DNA聚合酶合成可逆終止和帶有熒光信號的堿基；具體的，使用在3’糖羥基具有修飾的核苷酸，從而阻斷其它核苷酸的加入，通過熒光信號來區分4種不同的堿基。在去除阻斷和熒光基團后，恢復天然游離的3’羥基基團用于加入下一個核苷酸，并且去除熒光信號，以便于下一個堿基的合成和檢測。在SBS中，對于合成效率要求很高，在多個拷貝中一旦出現合成不完全的情況，就會導致信號的混亂，影響測序的讀長和準確性。而在邊合成邊測序中要求加入的帶有可逆阻斷和熒光基團的核苷酸，由于修飾的增加導致該核苷酸的分子較大，分子結構比較特殊，與沒有修飾的核苷酸相比，DNA聚合酶識別和合成這種帶修飾的dNTPs的效率較低，限制了聚合測序的讀長和準確度。

發明內容

本申請的目的是提供一種改進的新的提高核酸聚合測序質量的方法及其應用。

為了實現上述目的，本申請采用了以下技術方案：

本申請公開了一種提高核酸聚合測序質量的方法，包括在聚合測序的反應液中加入第二類核苷酸，第二類核苷酸具有在3’糖羥基上的阻斷修飾但沒有熒光修飾。

需要說明的是，本申請的關鍵在于，在聚合測序的反應液中加入了僅僅具有阻斷修飾的dNTPs，即第二類核苷酸。阻斷修飾的dNTPs對于DNA聚合酶識別和合成的影響相對較小，因此，第二類核苷酸的加入，能夠補充反應不完全的部分，提高合成反應的效率，降低反應不充分的風險；并且，由于第二類核苷酸沒有熒光修飾，降低了因為熒光切除不干凈，或者切除的熒光洗脫不干凈導致的信號干擾，提高了切除的效率，降低了測序錯誤率；從而起到提高測序質量的作用。可以理解，本申請的方法，其關鍵在于，在聚合測序的反應液中加入了僅僅具有阻斷修飾的第二類核苷酸，至于反應液其它組分，以及具體的反應條件，可以參考現有的聚合測序方法。

優選的，第二類核苷酸的用量，與反應液中第一類核苷酸的用量相同，第一類核苷酸為具有在3’糖羥基上的阻斷修飾并且具有熒光修飾的核苷酸。

需要說明的是，本申請中第一類核苷酸就是聚合測序中正常添加的核苷酸，本申請優選的方案中，第二類核苷酸和第一類核苷酸是等量加入的。可以理解，在一些特殊的設計方案中，第二類核苷酸的用量可以根據需求進行調整，但是，只要加入了第二類核苷酸都可以在一定程度上起到提高合成反應效率、降低測序錯誤率的效果。

本申請的另一面公開了本申請的方法在核酸測序中的應用。本申請的方法適用于人類基因組和其它動物、植物和微生物物種的核酸序列測序；主要應用包括WES、WGS、RNA、DNA等測序；本申請的一個實施例中，將本申請的方法用于大腸桿菌的DNA測序。

本申請的再一面公開了一種核酸測序方法，包括在邊合成邊測序的過程中，于其反應液中同時添加兩類核苷酸，第一核苷酸為具有在3’糖羥基上的阻斷修飾并且具有熒光修飾的核苷酸，第二類核苷酸為具有在3’糖羥基上的阻斷修飾但沒有熒光修飾的核苷酸。

可以理解，本申請的提高核酸聚合測序質量的方法，可以應用于各種基于邊合成邊測序的測序平臺，在不改變其測序條件和參數的情況下，只需要在其反應液中添加本申請的第二類核苷酸即可。