[發明專利]提高的衣康酸生產

有效

• 申請號: 201780064536.1
• 申請日: 2017-08-25
• 公開（公告）號: CN110036114B
• 公開（公告）日: 2023-09-29
• 發明（設計）人: 彼得·詹·潘特
• 申請（專利權）人: 勒薩弗爾公司
• 主分類號: C12P7/44
• 分類號: C12P7/44;C12N9/10;C12N9/88
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司 11204
• 代理人: 王達佐;洪欣

本發明涉及通過抑制衣康酰?CoA轉移酶、衣康酰?CoA水合酶(檸蘋酰?CoA水解酶；EC?4.2.1.56)和/或檸蘋酰?CoA裂解酶的表達或功能來增加微生物體中衣康酸生產的方法。還體現了微生物，優選土曲霉或黑曲霉，其中所述酶被抑制。

本發明涉及微生物生產領域，更具體地涉及衣康酸(衣康酸鹽)的生產，更具體地涉及真菌中的衣康酸鹽生產。

數十年來，衣康酸在微生物細胞中的生產和代謝已被廣泛研究(Calam,C.T.等人,1939,Thom.J.Biochem.,33:1488-1495；Bentley,R.和Thiessen,C.P.,1956,J.Biol.Chem.226:673-720；Cooper,R.A.和Kornberg,H.L.,1964,Biochem.J.,91:82-91；Bonnarme,P.等人,1995,J.Bacteriol.117:3573-3578；Dwiarti,L.等人,2002,J.Biosci.Bioeng.1:29-33)，但衣康酸的代謝途徑尚未明確地確定(Wilke,Th.和Vorlop,K.-D.,2001,Appl.Microbiol.Biotechnol.56:289-295；Bonnarme,P.等人,1995,J.Bacteriol.177:3573-3578)。在這方面的兩個復雜因素是：衣康酸的生物合成途徑被認為在細胞溶質和線粒體中發生(Jaklitsch,W.M.等人,1991,J.Gen.Microbiol.Appl.6:51-61)，以及已發現順烏頭酸酶(一種將檸檬酸互變為順式烏頭酸且反之亦然的酶)以及代謝途徑中的其他酶在微生物細胞中以許多同種型存在。

衣康酸生產現在在土曲霉(Aspergillus?terreus)中實現商業化，所述土曲霉與黑曲霉(Aspergillus?niger)和米曲霉(A.oryzae)具有生理相似性。然而，后兩者由于缺乏順式烏頭酸脫羧酶(CAD)活性而累積檸檬酸。這些真菌所使用的底物包括單糖和二糖，諸如葡萄糖、蔗糖和果糖以及淀粉(因為它們以可被微生物體降解的形式存在)、以及糖蜜。最近，已發現甘油也是土曲霉在衣康酸生產中的有用的底物(US?5,637,485)。

目前設想用于衣康酸生物合成的一般方案在圖21中給出，其中明確描述了在胞質溶膠和線粒體中均存在生物合成途徑，以及這兩個隔室間的連接。在該方案的數個方面存在嘗試改善微生物體中衣康酸的現有商業生產的可能性。

發明概述

本發明人現已發現所選用于增加衣康酸抗性和降低衣康酸降解和/或生化轉化的突變體菌株，因此產生了提高水平的衣康酸。此外，本發明人已發現抑制衣康酰-CoA轉移酶(EC?2.8.3.-)、衣康酰-CoA水合酶/檸蘋酰-CoA水解酶(EC?4.2.1.56)或檸蘋酰-CoA裂解酶(EC?4.1.3.25)的活性和/或抑制產生衣康酸的生物體(如曲霉屬)中編碼這些酶的基因的表達，能夠克服由衣康酸引起的毒性作用并同時促進衣康酸生產。因此，本發明包括通過增加對衣康酸的毒性作用的抗性和降低衣康酸降解和/或生化轉化來增加微生物體中衣康酸生產的方法。一種獲得增加的衣康酸生產的方法是通過選擇對衣康酸的毒性作用具有抗性的衣康酸生產生物體的突變體菌株。另一種方法是通過抑制酶衣康酰-CoA轉移酶(EC2.8.3.-)和/或衣康酰-CoA水合酶(檸蘋酰-CoA水解酶，EC?4.2.1.56)和/或檸蘋酰-CoA裂解酶(EC?4.1.3.25)的功能或抑制編碼這些酶的基因的表達。所述抑制可通過編碼所述衣康酰-CoA轉移酶和/或衣康酰-CoA水合酶(檸蘋酰-CoA水解酶)和/或檸蘋酰-CoA裂解酶(EC4.1.3.25)的基因的突變來實現，其中所述突變選自：

a)啟動子突變或誘導型啟動子插入；

b)編碼序列突變，其選自一個或多個核苷酸的插入、缺失或改變；

c)蛋白結合位點插入；和

d)它們的組合。

在一個可替代的實施方案中，所述酶的表達被沉默，其可通過以下實現：

a)反義沉默；