[發明專利]地衣芽孢桿菌中FLP介導的基因組整合

在審

• 申請號: 201780062901.5
• 申請日: 2017-10-23
• 公開（公告）號: CN109804072A
• 公開（公告）日: 2019-05-24
• 發明（設計）人: S·T·約根森
• 申請（專利權）人: 諾維信公司
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N1/20;C12N15/90
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 顧小曼;鄒亮

1.一種用于將至少一種目的多核苷酸以位點特異性方式整合至地衣芽孢桿菌宿主細胞的染色體中的方法，所述方法包括以下步驟：

(a)提供地衣芽孢桿菌宿主細胞，該地衣芽孢桿菌宿主細胞在其染色體中包含至少一個整合位點，每個整合位點包含一對來自釀酒酵母的位點特異性翻轉酶重組酶FLP或者其同源物或變體的識別序列；

(b)向所述細胞中引入核酸構建體，該核酸構建體也包含該位點特異性重組酶的識別序列對，所述序列對位于該目的多核苷酸的側翼；

(c)在該細胞中表達位點特異性FLP重組酶或其同源物，由此通過該FLP重組酶將該至少一個染色體識別序列對與該核酸構建體的相應識別序列對重組，以產生包含至少一種以位點特異性方式整合到該細胞的染色體中的目的多核苷酸的地衣芽孢桿菌宿主細胞。

2.如權利要求1所述的方法，其中該目的多核苷酸包含編碼至少一種目的多肽的操縱子或可讀框。

3.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中該目的多肽包含酶，優選地是水解酶、異構酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶、或轉移酶；更優選地是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、幾丁質酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、內切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β-木糖苷酶。

4.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中選擇或篩選標志位于該至少一個整合位點中的識別序列對之間。

5.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中該核酸構建體進一步包含引入的選擇標志和編碼該FLP重組酶或其同源物的多核苷酸。

6.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中將第二核酸構建體引入所述步驟(b)中的細胞中，該第二核酸構建體屬于非復制型或溫度敏感復制型，并且包含編碼FLP重組酶或其同源物的多核苷酸以及選擇標志，該選擇標志使正選擇或負選擇成為可能或者是可雙向選擇的，并且分別通過在允許的溫度下的選擇壓力或生長被瞬時維持在所述細胞中，使得該重組酶可以在步驟(c)中瞬時表達。

7.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中步驟(a)中的細胞在其染色體中包含至少一個編碼與嚴格調控的啟動子可操作地連接的重組酶的多核苷酸的拷貝，可通過改變生長條件而開啟和關閉該啟動子，從而使步驟(c)中位點特異性重組酶的瞬時表達成為可能。

8.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中該識別序列對由兩種不同的識別序列組成，優選的是與其衍生物組合的野生型FRT序列，更優選的是與選自下組的識別序列組合的野生型FRT序列，該組由以下組成：FRT-F、FRT-F3、FRT-F10、FRT-F13、FRT-F14、FRT-F15、FRT-Fa和FRT-F3a。

9.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中步驟(a)的地衣芽孢桿菌宿主細胞在其染色體中包含兩個或更多個整合位點，并且產生了包含兩個或更多個以位點特異性方式整合至該細胞的染色體中的目的多核苷酸的地衣芽孢桿菌宿主細胞；優選地，步驟(a)的地衣芽孢桿菌宿主細胞在其染色體中包含三個或更多個整合位點；更優選地四個或更多個、五個或更多個、或者七個或更多個整合位點，并且其中產生了包含三個、四個、五個、六個或更多個以位點特異性方式整合至該細胞的染色體中的目的多核苷酸的地衣芽孢桿菌宿主細胞。

10.一種原核宿主細胞，所述原核宿主細胞在其基因組中包含至少兩種編碼目的多肽的多核苷酸，其中每種多核苷酸的側翼為針對位點特異性重組酶的識別序列對。