[發明專利]制備包含親脂性修飾的賴氨酸側鏈的肽的方法

在審

• 申請號: 201780062214.3
• 申請日: 2017-10-10
• 公開（公告）號: CN109790208A
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發明（設計）人: B·亨克爾;N·普洛伊斯;R-L·赫爾萊因
• 申請（專利權）人: 賽諾菲
• 主分類號: C07K14/605
• 分類號: C07K14/605;C07K1/00;C07K1/04;C07K1/06;C07K1/107;C07K14/46;C07K14/575
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所 11494
• 代理人: 封新琴

1.一種制備包含親脂性修飾的賴氨酸側鏈的分離的肽的方法，其包括以下步驟：

(i)使用固相肽合成(SPPS)以逐步方式裝配側鏈中具有受保護的反應性官能團的所述肽的氨基酸序列，其中通過基于三苯甲基的保護基團，特別是單甲氧基三苯甲基(Mmt)或4-甲基三苯甲基(Mtt)保護要修飾的賴氨酸的側鏈；

(ii)在完成了所述氨基酸序列的裝配后干燥固相樹脂；

(iii)用二氯甲烷(DCM)中的三氟乙酸(TFA)溶液將干燥的樹脂處理幾次以使要修飾的賴氨酸側鏈脫保護；

(iv)中和所述樹脂；

(v)將至少一個活化的9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)結合的接頭部分與脫保護的賴氨酸側鏈偶聯；

(vi)使步驟(v)中與所述賴氨酸側鏈偶聯的所述接頭的末端官能團脫保護；

(vii)將活化的親脂性部分，特別是活化的脂肪酸，與步驟(vi)中的所述接頭的脫保護的末端官能團偶聯；

(viii)干燥所述樹脂；和

(ix)從所述樹脂中切割所述肽。

2.權利要求1的方法，其中所述分離的肽是具有30-44個，特別是38-40個氨基酸的長度的毒蜥外泌肽-4衍生物，其中

(i)在與野生型毒蜥外泌肽的氨基酸1-13對應的區域中與野生型毒蜥外泌肽-4的序列同一性是至少65％，和/或

(ii)在與野生型毒蜥外泌肽的氨基酸22-39對應的區域中與野生型毒蜥外泌肽-4的序列同一性是至少70％，和/或

(iii)所述親脂性修飾的賴氨酸側鏈是就野生型毒蜥外泌肽-4的氨基酸位置而言的第14位(Lys(14))。

3.權利要求1或2的方法，其中在步驟(iii)中，用約1％(v/v)TFA的DCM溶液將所述干燥的樹脂處理至少7次達至少5分鐘，特別是9次達至少10分鐘或9次達至少15分鐘。

4.前述權利要求中任一項的方法，其進一步包括以下步驟：

(viii-a)通過切割樹脂結合肽的測試樣品分析步驟(iii)的脫保護產率；和

(viii-b)任選地重復步驟(iii)至(viii-a)，直至與不含修飾的賴氨酸側鏈的肽相比，含有所述修飾的賴氨酸側鏈的切割肽的含量是至少85％，特別是至少90％，更特別是至少95％。

5.前述權利要求中任一項的方法，其中所述分離的肽具有以下氨基酸序列

H-dS-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-Palm)-E-S-K-A-A-Q-D-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH₂(SEQ ID NO.:1)。

6.前述權利要求中任一項的方法，其中用包含至少90％(v/v)三氟乙酸和至少1％(v/v)乙二硫醇的切割混合物進行步驟(ix)的切割，所述切割混合物不含苯甲硫醚和乙基甲基硫醚。

7.權利要求8的方法，其中所述切割混合物進一步包含合適的吲哚化合物，特別是3-甲基吲哚。

8.權利要求1-5中任一項的方法，其中用包含至少80％(w/w)三氟乙酸和至少1％(w/w)1,2-乙二硫醇的切割混合物進行步驟(ix)的切割，所述切割混合物不含苯甲硫醚和乙基甲基硫醚。

9.權利要求8的方法，其中所述切割混合物由88.2-98.3％(w/w)三氟乙酸、1-4.3％(w/w)1,2-乙二硫醇和0.7-7.5％(w/w)3-甲基吲哚構成。

10.前述權利要求中任一項的方法，其進一步包括以下步驟：

(x)在切割后過濾肽溶液；

(xi)在真空下蒸餾過濾的肽溶液；

(xii)將來自蒸餾的殘留級分添加到包含二烷基醚和庚烷的抗溶劑中；

(xiii)攪拌沉淀的溶液；

(xiv)過濾沉淀的溶液；

(xv)清洗沉淀物；和

(xvi)干燥濕的肽。