[發(fā)明專利]用于快速克隆T細(xì)胞受體的組合物和方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201780059967.9
• 申請(qǐng)日: 2017-08-01
• 公開（公告）號(hào): CN109804246B
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 坤勒·奧頓斯;理查德·科亞;塔克馬薩·特蘇基
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 健康研究公司
• 主分類號(hào): G01N33/53
• 分類號(hào): G01N33/53;G01N33/566;G01N33/574;C12N5/0783;C12N15/12;C12N15/85;C07K14/725
• 代理公司: 北京清亦華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11201
• 代理人: 宋融冰

1.一種從寡克隆T細(xì)胞群體的T細(xì)胞受體克隆多種TCRα鏈和β鏈可變序列的方法，所述方法包括：

1)從所述寡克隆T細(xì)胞群體獲得RNA，其中所述RNA包含編碼TCRα鏈和β鏈可變序列的mRNA，并且從所述mRNA產(chǎn)生第一單鏈cDNA，其中所述第一單鏈cDNA包括編碼所述TCRα鏈的單鏈cDNA和編碼所述TCRβ鏈的單鏈cDNA，其中采用寡聚dT引物通過逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生所述單鏈cDNA以獲得從所述mRNA擴(kuò)增的第一鏈cDNA的樣品；

2)將1)中的所述樣品分成第一樣品和第二樣品并且進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，所述反應(yīng)包括：

采用以下所有引物在所述第一樣品中進(jìn)行第二鏈cDNA合成以獲得編碼所述TCRβ鏈的雙鏈cDNA擴(kuò)增子，

采用以下所有引物在所述第二樣品中進(jìn)行第二鏈cDNA合成以獲得編碼所述TCRα鏈的雙鏈cDNA擴(kuò)增子，

3)將所述第一樣品和所述第二樣品與核酸外切酶孵育一段時(shí)期，以足以降解未合并到所述擴(kuò)增子的引物和可能存在的單鏈cDNA，隨后利用熱處理使所述核酸外切酶失活；

4)采用標(biāo)簽特異性引物

HTTCR#A-ACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCTGCGGCCGCCACCATG(SEQ ID NO：1)和引物HTTCR#B-CTCAAACACAGCGACCTCGGGTGGGAACAC(SEQ ID NO：2)在所述第一樣品中對(duì)編碼TCRβ鏈的擴(kuò)增子進(jìn)行PCR擴(kuò)增以獲得所述編碼TCRβ鏈的擴(kuò)增子，其中所述編碼TCRβ鏈的擴(kuò)增子還包含限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)、Kozak序列和翻譯起始ATG序列；

采用標(biāo)簽特異性引物HTTCR#D GGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCCATG(SEQ ID NO：48)和HT-TCR#E AGGCAGACAGACTTGTCACTGGATTTAGAG(SEQ ID NO：49)在所述第二樣品中對(duì)編碼TCRα鏈的擴(kuò)增子進(jìn)行PCR擴(kuò)增以獲得所述編碼TCRα鏈的擴(kuò)增子，其中所述TCRα鏈的擴(kuò)增子還包含P2A序列和起始ATG序列；和

5)將4)中的所述編碼TCRβ鏈的擴(kuò)增子和所述編碼TCRα鏈的擴(kuò)增子組裝成DNA載體，以提供多種DNA載體，每種DNA載體包含編碼僅一種TCRβ鏈和僅一種TCRα鏈的DNA區(qū)段，其中所述載體包含編碼TCRβ鏈的區(qū)段和編碼TCRα鏈的區(qū)段之間的Cβ-2A融合區(qū)段，從而提供多種DNA載體，所述多種DNA載體中的每種載體僅編碼所述寡克隆T細(xì)胞群體的所述TCR的單種TCRβ鏈和單種TCRα鏈。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述寡克隆T細(xì)胞群體獲得自癌癥腫瘤。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述腫瘤包括膀胱癌、腦癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、骨髓瘤、肉瘤、由白血病、淋巴瘤或黑素瘤形成的腫瘤，和/或其中所述腫瘤包括表達(dá)以下至少一種的免疫原性腫瘤抗原的癌細(xì)胞：NY-ESO-1、WT1、MUC1、LMP2、HPV E6、HPV E7、EGFRvIII、HER2/neu、MAGE-A3、p53、NY-ESO-1、PSMA、GD2、CEA、MalanA/MART1、突變Ras、gp100、蛋白酶3、bcr-abl、酪氨酸酶、存活素、PSA、hTERT、MAGE-A1、MAGE-A4、MAGE-C1、MAGE-C2、PLAC1、Sp17、TRP-2、周期素B1、間皮素、葉酸受體α和患者特異性新抗原。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中5)中的所述DNA載體能夠在淋巴細(xì)胞中表達(dá)所述TCRα鏈和所述TCRβ鏈，使得所述淋巴細(xì)胞表現(xiàn)出針對(duì)由所述癌癥腫瘤表達(dá)的抗原的抗原特異性。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，包括向淋巴細(xì)胞中引入至少一種5)中的DNA載體，并且允許由至少一種載體編碼的所述TCRβ鏈和所述TCRα鏈的表達(dá)，使得所述淋巴細(xì)胞表達(dá)包含所述TCRβ鏈和所述TCRα鏈的功能性TCR。