[發明專利]防止模板轉換期間連環化的方法和組合物

在審

• 申請號: 201780057458.2
• 申請日: 2017-07-28
• 公開（公告）號: CN109790535A
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發明（設計）人: S·管;T·C·小埃文斯;N·尼克爾斯;Y·貝
• 申請（專利權）人: 新英格蘭生物實驗室公司
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/10;C12N15/11;C12N15/113;C12P19/34;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 王永偉;顏芳

1.組合物，其包含：

(a)逆轉錄酶；

(b)模板轉換寡核苷酸，包含位點特異性核酸切割酶的識別序列，其中所述模板轉換寡核苷酸在其3’端具有能與通過逆轉錄酶添加到模板cDNA鏈的一個或多個非模板核苷酸雜交的至少一個核苷酸；和

(c)所述位點特異性核酸切割酶。

2.權利要求1所述的組合物，其進一步包含RNA模板。

3.權利要求1或2所述的組合物，其中所述RNA模板是總RNA或聚A⁺RNA。

4.權利要求1至3中任一項所述的組合物，其中所述RNA模板是來自哺乳動物的RNA。

5.權利要求1至4中任一項所述的組合物，其中所述RNA模板包含5’修飾GMP帽。

6.權利要求5所述的組合物，其中所述5’修飾GMP帽是7-甲基鳥苷或親和標簽標記的GMP帽。

7.權利要求1至6中任一項所述的組合物，其進一步包含cDNA合成引物，其中所述cDNA合成引物是寡(dT)引物、隨機引物、或轉錄物特異性引物。

8.權利要求1至7中任一項所述的組合物，其進一步包含具有不與所述RNA模板雜交的5’尾的cDNA合成引物。

9.權利要求1至8中任一項所述的組合物，其中所述模板轉換寡核苷酸是DNA-RNA嵌合體。

10.權利要求1至9中任一項所述的組合物，其中所述模板轉換寡核苷酸在所述位點特異性核酸切割酶的所述識別序列與其3'端處與所述模板cDNA鏈的3’端處的所述非模板核苷酸互補的所述至少一個核苷酸之間包含擴增引物序列、和任選地分子條形碼序列。

11.權利要求1至10中任一項所述的組合物，其中所述模板轉換寡核苷酸在其3'端處包含3個核糖鳥嘌呤殘基。

12.權利要求1至11中任一項所述的組合物，其中所述逆轉錄酶選自莫洛尼氏鼠白血病毒(M-MLV)、缺乏RNA酶H活性的M-MLV逆轉錄酶、人T細胞白血病毒I型(HTLV-I)逆轉錄酶、牛白血病病毒(BLV)逆轉錄酶、勞斯氏肉瘤病毒(RSV)逆轉錄酶、人免疫缺陷病毒(HIV)逆轉錄酶；和其變體。

13.根據權利要求1至12中任一項所述的組合物，其中所述逆轉錄酶是熱穩定的。

14.根據權利要求1至13中任一項所述的組合物，其中所述位點特異性核酸切割酶切割雙鏈DNA。

15.根據權利要求1至14中任一項所述的組合物，其中所述位點特異性核酸切割酶是熱穩定的。

16.權利要求1至14中所述的組合物，其中所述位點特異性核酸切割酶在20℃至65℃范圍內的溫度下是活性的。

17.權利要求1至15中任一項所述的組合物，其中所述位點特異性核酸切割酶選自限制性核酸內切酶；N-糖基化酶；裂解酶(N-糖基化酶-裂解酶)；核酸內切酶；cas9直向同源物；和Argonaut直向同源物。

18.權利要求16所述的組合物，其中所述位點特異性核酸切割酶能夠在比模板轉換寡核苷酸切割的反應溫度高至少10攝氏度的溫度下10分鐘后被滅活。