[發明專利]用于修飾基因組DNA的方法和組合物

在審

• 申請號: 201780056976.2
• 申請日: 2017-07-21
• 公開（公告）號: CN109844103A
• 公開（公告）日: 2019-06-04
• 發明（設計）人: 李林鴻;康奈爾·艾倫;馬杜蘇登·佩什瓦
• 申請（專利權）人: 美克斯細胞有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N9/22;C12N15/82;C12N15/90
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 鄭斌;彭鯤鵬

1.用于細胞中的靶基因組DNA區域的位點特異性序列修飾的方法，其包括：

用組合物通過電穿孔轉染所述細胞，所述組合物包含(a)DNA寡核苷酸；(b)DNA消化劑；和(c)靶向RNA，其中所述靶向RNA是加帽的和/或多腺苷酸化的；

其中所述DNA寡核苷酸包含：

(i)包含與所述靶基因組DNA區域同源的DNA序列的同源區域；和

(ii)序列修飾區域；并且

其中所述基因組DNA序列在所述靶基因組DNA區域特異性修飾。

2.權利要求1所述的方法，其中電穿孔是使用流式電穿孔裝置的流式電穿孔。

3.權利要求1至2中任一項所述的方法，其中所述DNA消化劑是核酸酶。

4.權利要求3所述的方法，其中所述核酸酶包含Cas9。

5.權利要求3至4中任一項所述的方法，其中所述核酸酶是位點特異性核酸酶。

6.權利要求5所述的方法，其中所述靶向RNA包含指導RNA。

7.權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述靶向RNA是加帽的和多腺苷酸化的。

8.權利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述靶向RNA在體外加帽和多腺苷酸化。

9.權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述寡核苷酸是單鏈的。

10.權利要求9所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸和靶向RNA與所述靶基因組DNA區域的相同鏈互補。

11.權利要求1至9中任一項所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸是多于10個核酸。

12.權利要求11所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸是10至800個核酸。

13.權利要求12所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸是10至600個核酸。

14.權利要求13所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸是10至200個核酸。

15.權利要求14所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸是10至100個核酸。

16.權利要求15所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸是10至50個核酸。

17.權利要求1至16中任一項所述的方法，其中所述組合物中所述DNA寡核苷酸的濃度大于10μg/mL。

18.權利要求17所述的方法，其中所述組合物中所述DNA寡核苷酸的濃度為約10至約500μg/mL。

19.權利要求18所述的方法，其中所述組合物中所述DNA寡核苷酸的濃度為約35至約300μg/mL。

20.權利要求19所述的方法，其中所述組合物中所述DNA寡核苷酸的濃度為約35至約200μg/mL。

21.權利要求1至20中任一項所述的方法，其中所述組合物是非病毒的。

22.權利要求1至21中任一項所述的方法，其中所述細胞是哺乳動物細胞。

23.權利要求22所述的方法，其中所述細胞是人細胞。

24.權利要求22所述的方法，其中所述細胞是成纖維細胞。