[發明專利]用于產生雙鏈梭菌神經毒素的方法

在審

• 申請號: 201780056927.9
• 申請日: 2017-09-13
• 公開（公告）號: CN109715820A
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發明（設計）人: D·克萬
• 申請（專利權）人: 益普生生物制藥有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K14/33
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 凌立;黃革生

本發明提供避開活化步驟需要的適合用于重組產生雙鏈梭菌神經毒素的方法、細胞和試劑盒，以及由此獲得的適合用于治療的雙鏈梭菌神經毒素。

技術領域

本發明提供避開活化步驟需要的用于重組產生雙鏈梭菌神經毒素的方法。

背景技術

梭菌屬(Clostridia)細菌產生高度有效和特異的蛋白質毒素，這些蛋白質毒素可使它們所遞送至的神經元和其他細胞中毒。這類梭菌毒素的實例包括由破傷風梭菌(C.tetani)(TeNT)及由肉毒梭菌(C.botulinum)(BoNT)血清型A-G產生的神經毒素，以及由巴氏梭菌(C.baratii)和丁酸梭菌(C.butyricum)產生的那些。

已知在梭菌毒素中有一些最有效的毒素。作為實例，肉毒梭菌神經毒素(botulinum neurotoxin)對小鼠的半數致死劑量取決于血清型在從0.5至5ng/kg的范圍內。破傷風和肉毒毒素都通過抑制所影響的神經元功能，尤其是神經遞質的釋放來發揮作用。肉毒毒素在神經肌肉接頭處發揮作用并抑制周圍神經系統中的膽堿能傳遞，而破傷風毒素在中樞神經系統中發揮作用。

梭菌神經毒素通過蛋白酶解切割稱為SNARE蛋白(例如SNAP-25、VAMP或突觸融合蛋白)的胞內轉運蛋白發揮作用——參見Gerald K(2002)Cell and Molecular Biology”(第4版)John Wiley&Sons,Inc.。首字母縮略詞SNARE源自術語可溶性NSF附著受體(Soluble NSF Attachment Receptor)，其中NSF意指N-乙基馬來酰亞胺敏感因子(N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)。SNARE蛋白是胞內小泡融合從而通過小泡運輸從細胞分泌分子所不可或缺的。蛋白酶功能是鋅依賴性內肽酶活性，且對SNARE顯示高底物特異性。因此，一旦遞送至所希望的靶細胞，非細胞毒性蛋白酶即能夠抑制來自靶細胞的細胞分泌。

在自然界中，梭菌神經毒素作為單鏈多肽合成，該單鏈多肽翻譯后通過蛋白酶解切割事件修飾形成通過二硫鍵連接在一起的兩條多肽鏈。切割發生在通常稱為活化位點的特異性切割位點，該位點位于提供鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基之間。只有通過此活化事件，才能達到梭菌神經毒素的完全功效。兩條鏈稱為重鏈(H鏈)(其具有約100kDa的分子量)和輕鏈(L鏈)(其具有約50kDa的分子量)。H鏈包含N端易位成分(H_N結構域)和C端靶向成分(H_C結構域)。切割位點位于L鏈和易位結構域成分之間。在H_C結構域結合其靶神經元且所結合的毒素通過內體內化進入細胞之后，H_N結構域使L鏈跨內體膜易位，進入細胞質溶膠，L鏈提供蛋白酶功能(也稱為非細胞毒性蛋白酶)。

肉毒梭菌神經毒素以其引起松弛性肌肉麻痹和抑制膽堿能分泌的能力為人們所熟知。這些特性導致肉毒梭菌神經毒素用于多種醫療和美容流程，包括眉間線或運動過度面線、頭痛、半面痙攣、膀胱過度活動、多汗、鼻唇線、頸肌張力障礙、眼瞼痙攣、痙攣和多汗的治療。

目前所有批準的含有BoNT的藥物/化妝品制劑包含從梭菌菌株純化的天然存在的神經毒素(在或的情況下為BoNT/A，在的情況下為BoNT/B)。傳統的BoNT產品生產是通過培養肉毒梭菌后分離和純化肉毒梭菌神經毒素復合物或復合的游離神經毒素來進行。肉毒梭菌是產芽孢細菌，因此需要笨重的特殊培養設備和設施。因此在異源宿主如大腸桿菌(E.coli)中重組產生BoNT可以是有利的。但是，重組制備梭菌神經毒素的限制步驟是活化步驟。