[發明專利]通過定點DNA裂解和修復靶向原位蛋白質多樣化

有效

• 申請號: 201780046643.1
• 申請日: 2017-07-31
• 公開（公告）號: CN109563508B
• 公開（公告）日: 2023-07-07
• 發明（設計）人: D·吳;O·格里斯貝克;M·埃爾多安
• 申請（專利權）人: 馬克思—普朗克科學促進協會公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C40B30/06;C12N15/90
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 柴云峰;黃革生

1.一種產生表達目的蛋白質的突變變體的一組細胞的方法，其中所述目的蛋白質的所述突變變體之一是按每個細胞從單個基因拷貝表達，所述方法包括：

a)在細胞基因組中的用于在編碼所述目的蛋白質的基因中進行誘變的靶位點處或附近誘導雙鏈斷裂(DSB)或單鏈切口，其中所述編碼所述目的蛋白質的基因是以單拷貝包含在所述細胞的基因組中，并且其中所述編碼所述目的蛋白質的基因的單拷貝包含在所述用于誘變的靶位點處或附近的失活突變；

b)向步驟a)的細胞提供不同供體核酸模板的庫，用于經由同源重組來修復經誘導的DSB或單鏈切口，其中所述庫的不同供體核酸模板在對應于所述用于誘變的靶位點的位置處包含不同的突變，并通過同源定向修復(HDR)去除所述失活突變；

c)選擇和/或富集已去除失活突變的細胞；和

d)提供在步驟c)中選擇的一組細胞，其是表達所述目的蛋白質的不同突變變體的一組細胞，其中所述目的蛋白質的所述不同突變變體之一是按每個細胞從單基因拷貝表達的。

2.權利要求1的方法，其中所述失活突變阻止所述目的蛋白質的表達。

3.權利要求1或2的方法，其中所述編碼所述目的蛋白質的基因作為融合基因包含在所述細胞的基因組中，其中所述融合基因包含所述編碼目的蛋白質的基因下游的標記基因；并且其中編碼所述目的蛋白質的基因中的所述失活突變阻止所述標記基因的表達。

4.權利要求3的方法，其中所述標記基因編碼熒光蛋白。

5.權利要求1至4中任一項的方法，其中所述雙鏈斷裂是通過使用位點特異性核酸酶進行的，所述位點特異性核酸酶選自Cas9核酸酶，Cpf1核酸酶，鋅指核酸酶(ZNF)，轉錄激活因子樣核酸酶(TALEN)和megaTAL內切核酸酶；或其中所述單鏈切口是通過使用位點特異性切口酶進行的，所述位點特異性切口酶是Cas9切口酶。

6.權利要求1至5中任一項的方法，其中所述細胞是哺乳動物細胞。

7.權利要求1至6中任一項的方法，其中所述方法還包括確定編碼在步驟c)中選擇和/或富集的和/或在d)中提供的細胞中包含的編碼所述目的蛋白質的所述不同突變變體的一種或多種基因的核酸序列；或測定包含在步驟c)中選擇和/或富集和/或d)中提供的細胞中的目的蛋白質的一種或多種所述不同突變變體的氨基酸序列。

8.權利要求1至7中任一項的方法，其中所述目的蛋白質是熒光蛋白，抗體，酶，生長因子，細胞因子，肽激素，轉錄因子，RNA結合蛋白，細胞骨架蛋白，離子通道，G蛋白偶聯受體，分子伴侶，轉運蛋白或跨膜蛋白。

9.權利要求1至8中任一項的方法，其中所述目的蛋白質是激酶或磷酸酶。

10.權利要求1至9中任一項的方法，其中：

(i)所述目的蛋白質是抗體，并且其中所述用于誘變的靶位點在編碼所述抗體的重鏈或輕鏈的核酸序列的CDR編碼區中；或

(ii)所述目的蛋白質是酶，并且其中所述用于誘變的靶位點在編碼所述酶的活性中心或所述酶的調節亞基的核酸區域中。

11.權利要求1至10中任一項的方法，其中所述目的蛋白質的所述突變變體與野生型目的蛋白質相比，第一活性得到改善和/或具有新活性，其中所述方法還包括：

e)從所述細胞組中選擇和/或富集第二組細胞，該第二組細胞表達所述目的蛋白質的突變變體，所述突變變體的所述第一活性得到改善和/或具有所述新活性。

12.權利要求1至10中任一項的方法，其中所述目的蛋白質的所述突變變體與野生型目的蛋白質相比，第一活性得到改善和/或具有新活性，并且其中步驟c)包括選擇和/或富集目的蛋白質的突變變體，所述突變變體與野生型目的蛋白質相比第一活性得到改善和/或具有新活性。