[發(fā)明專利]單細(xì)胞全基因組文庫及制備其的組合索引方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201780044234.8
• 申請日: 2017-07-21
• 公開（公告）號: CN110268059A
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 安德魯·C·阿迪;莎拉·A·維塔克;弗蘭克·J·斯蒂莫斯
• 申請（專利權(quán)）人: 俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué);伊魯米那股份有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京安信方達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11262
• 代理人: 王瑋瑋;鄭霞

1.一種制備包含來自多個單細(xì)胞的核酸的測序文庫的方法，所述方法包括：

(a)提供來自多個細(xì)胞的分離的細(xì)胞核；

(b)使所述分離的細(xì)胞核經(jīng)受化學(xué)處理以生成核小體耗盡的細(xì)胞核，同時維持所述分離的細(xì)胞核的完整性；

(c)將所述核小體耗盡的細(xì)胞核的子集分布到第一多個隔室中并且使每個子集與轉(zhuǎn)座體復(fù)合物接觸，其中每個隔室中的所述轉(zhuǎn)座體復(fù)合物包含轉(zhuǎn)座酶和與其他隔室中的第一索引序列不同的第一索引序列；

(d)將核小體耗盡的細(xì)胞核的所述子集中的核酸片段化成多個核酸片段，并且將所述第一索引序列摻入所述核酸片段的至少一條鏈中以生成包含加索引的核酸片段的加索引的細(xì)胞核，其中所述加索引的核酸片段保持附接至所述轉(zhuǎn)座酶；

(e)將所述加索引的細(xì)胞核組合以生成合并的加索引的細(xì)胞核；

(f)將所述合并的加索引的細(xì)胞核的子集分布到第二多個隔室中；

(g)將第二索引序列摻入每個隔室中的所述加索引的核酸片段中以生成雙索引片段，其中每個隔室中的所述第二索引序列與其他隔室中的第二索引序列不同；

(h)組合所述雙索引片段，從而產(chǎn)生包含來自所述多個單細(xì)胞的全基因組核酸的測序文庫。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化學(xué)處理包括用能夠破壞核酸-蛋白相互作用的離液劑處理。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述離液劑包括3,5-二碘水楊酸鋰。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述化學(xué)處理包括用能夠破壞核酸-蛋白相互作用的洗滌劑處理。

5.如權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述洗滌劑包括十二烷基硫酸鈉(SDS)。

6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述細(xì)胞核在步驟(b)之前用交聯(lián)劑處理。

7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述交聯(lián)劑是甲醛。

8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中甲醛的濃度的范圍為從約0.2％至約2％。

9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中甲醛的濃度不大于約1.5％。

10.如權(quán)利要求7所述的方法，其中通過甲醛的交聯(lián)在步驟(f)之后且在步驟(g)之前被逆轉(zhuǎn)。

11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述交聯(lián)的逆轉(zhuǎn)包括在約55℃至約72℃孵育。

12.如權(quán)利要求10或11中任一項(xiàng)所述的方法，其中在所述交聯(lián)的逆轉(zhuǎn)之前，所述轉(zhuǎn)座酶與所述加索引的核酸片段解離。

13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中使用十二烷基硫酸鈉(SDS)使所述轉(zhuǎn)座酶與所述加索引的核酸片段解離。

14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞核在步驟(d)之前用限制酶處理。

15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述細(xì)胞核在用所述限制酶處理后用連接酶處理。

16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(c)和步驟(f)中的所述分布通過熒光激活細(xì)胞核分選執(zhí)行。

17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核小體耗盡的細(xì)胞核的所述子集包含大致相等數(shù)量的細(xì)胞核。

18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述核小體耗盡的細(xì)胞核的所述子集包含從1至約2000個細(xì)胞核。

19.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一多個隔室是多孔板。