[發(fā)明專利]用于使用多個(gè)引導(dǎo)RNA來破壞免疫耐受性的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201780044071.3
• 申請(qǐng)日: 2017-05-19
• 公開（公告）號(hào): CN109475109B
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 維拉·沃羅寧那;林恩·麥克唐納;馬林·普里塞特;卡曼·維納斯·萊;阿肖克·巴迪斯;安德魯·J.·莫菲;古斯塔沃·德羅格特;大衛(wèi)·佛倫杜威;布萊恩·扎姆布羅維茲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 瑞澤恩制藥公司
• 主分類號(hào): C07K16/18
• 分類號(hào): C07K16/18;C12N15/90;C12N15/85;C07K16/00;A01K67/027
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

1.一種產(chǎn)生針對(duì)目標(biāo)外來抗原的抗原結(jié)合蛋白的方法，其包括：

(a)制備對(duì)目標(biāo)外來抗原的耐受性降低的經(jīng)遺傳修飾的、為大鼠或小鼠的非人動(dòng)物，其包括：

(i)向一群大鼠或小鼠單細(xì)胞期胚胎或一群大鼠或小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞中引入：

(I)Cas9蛋白或編碼所述Cas9蛋白的核酸；

(II)雜交至靶基因組基因座內(nèi)的第一引導(dǎo)RNA識(shí)別序列的第一引導(dǎo)RNA或編碼所述第一引導(dǎo)RNA的DNA，其中所述靶基因組基因座包含編碼與所述目標(biāo)外來抗原同源或共有目標(biāo)表位的自身抗原的基因的全部或一部分；和

(III)雜交至所述靶基因組基因座內(nèi)的第二引導(dǎo)RNA識(shí)別序列的第二引導(dǎo)RNA或編碼所述第二引導(dǎo)RNA的DNA；

(ii)從所述一群大鼠或小鼠單細(xì)胞期胚胎或所述一群大鼠或小鼠ES細(xì)胞中篩選經(jīng)修飾的大鼠或小鼠單細(xì)胞期胚胎或經(jīng)修飾的大鼠或小鼠ES細(xì)胞，其中在一對(duì)相應(yīng)第一染色體和第二染色體中所述靶基因組基因座被修飾以產(chǎn)生具有雙等位基因修飾的所述經(jīng)修飾的大鼠或小鼠單細(xì)胞期胚胎或所述經(jīng)修飾的大鼠或小鼠ES細(xì)胞，其中所述自身抗原的表達(dá)被消除；和

(iii)從所述經(jīng)修飾的大鼠或小鼠單細(xì)胞期胚胎或所述經(jīng)修飾的大鼠或小鼠ES細(xì)胞產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的F0代大鼠或小鼠，其中在所述經(jīng)遺傳修飾的F0代大鼠或小鼠中的所述一對(duì)相應(yīng)第一染色體和第二染色體中所述靶基因組基因座被修飾以使所述自身抗原的表達(dá)被消除；

(b)用所述目標(biāo)外來抗原使在步驟(a)中產(chǎn)生的所述經(jīng)遺傳修飾的F0代大鼠或小鼠免疫；和

(c)在足以引發(fā)對(duì)所述目標(biāo)外來抗原的免疫應(yīng)答的條件下維持所述經(jīng)遺傳修飾的F0代大鼠或小鼠，其中所述經(jīng)遺傳修飾的F0代大鼠或小鼠產(chǎn)生針對(duì)所述目標(biāo)外來抗原的抗原結(jié)合蛋白。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述Cas9蛋白具有雙鏈斷裂誘導(dǎo)活性，并且其中所述Cas9蛋白和所述引導(dǎo)RNA在所述靶基因組基因座內(nèi)的不同位點(diǎn)處產(chǎn)生成對(duì)雙鏈斷裂。

3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中步驟(a)(i)中的所述細(xì)胞或胚胎是所述大鼠或小鼠ES細(xì)胞，并且在步驟(a)(iii)中產(chǎn)生所述經(jīng)遺傳修飾的F0代大鼠或小鼠包括：

(I)將所述經(jīng)修飾的大鼠或小鼠ES細(xì)胞引入宿主胚胎中；和

(II)將所述宿主胚胎植入代孕母體中以產(chǎn)生所述經(jīng)遺傳修飾的F0代大鼠或小鼠，其中所述一對(duì)相應(yīng)第一染色體和第二染色體中的所述靶基因組基因座被修飾以使所述自身抗原的表達(dá)被消除。

4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中步驟(a)(i)中的所述細(xì)胞或胚胎是所述大鼠或小鼠單細(xì)胞期胚胎，并且在步驟(a)(iii)中產(chǎn)生所述經(jīng)遺傳修飾的F0代大鼠或小鼠包括將所述經(jīng)修飾的大鼠或小鼠單細(xì)胞期胚胎植入代孕母體中以產(chǎn)生所述經(jīng)遺傳修飾的F0代大鼠或小鼠，其中所述一對(duì)相應(yīng)第一染色體和第二染色體中的所述靶基因組基因座被修飾以使所述自身抗原的表達(dá)被消除。

5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其進(jìn)一步包括：

(d)(i)從分離自經(jīng)免疫的經(jīng)遺傳修飾F0代大鼠或小鼠的B細(xì)胞制備雜交瘤；或

(ii)從所述經(jīng)免疫的經(jīng)遺傳修飾F0代大鼠或小鼠獲得編碼針對(duì)所述目標(biāo)外來抗原的所述抗原結(jié)合蛋白的免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域的第一核酸序列和/或編碼針對(duì)所述目標(biāo)外來抗原的所述抗原結(jié)合蛋白的免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的第二核酸序列。

6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述第一核酸序列和/或所述第二核酸序列從所述經(jīng)遺傳修飾的F0代大鼠或小鼠的淋巴細(xì)胞或從由所述淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的雜交瘤獲得。

7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述經(jīng)遺傳修飾的F0代小鼠或大鼠包含人源化免疫球蛋白基因座，并且其中所述第一核酸序列編碼人免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域，并且所述第二核酸序列編碼人免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。