[發(fā)明專利]使用固體對象的核酸提取方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201780043894.4
• 申請日: 2017-05-15
• 公開（公告）號: CN109804078B
• 公開（公告）日: 2022-08-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 慎鏞
• 申請（專利權(quán)）人: 注入技術(shù)公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;B01L3/00
• 代理公司: 北京信慧永光知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11290
• 代理人: 王芬;張淑珍

本發(fā)明涉及使用固體對象的核酸提取方法。相比傳統(tǒng)核酸提取方法，通過在對象中形成核酸樣品和亞氨酸酯化合物(imidoester compound)之間的復(fù)合物能夠以更簡單且成本更低的方式分離大量的和高純度的核酸。特別是，與傳統(tǒng)硅基材相比，用于提取核酸的薄膜設(shè)備具有改善的親水性能，因此可更有效地提取核酸。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及使用固體對象提取核酸的方法，更具體而言，涉及通過簡單方法從核酸來源(包括各種真核細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、病毒細(xì)胞或體液)中提取核酸的方法。

背景技術(shù)

核酸是鑒別疾病狀態(tài)的重要分析工具，并且DNA生物標(biāo)志物(如單核苷酸多態(tài)性(SNP))、突變或DNA甲基化幫助研究人員發(fā)現(xiàn)癌癥的原因，在疾病早期階段診斷和觀察疾病狀況，以及為監(jiān)測和預(yù)后的巨大機(jī)會提供了重要線索。

因為與其它組分(如蛋白質(zhì))相比，核酸(如DNA)的生理濃度非常低(例如，每微升全血數(shù)十納克的DNA對比數(shù)十微克的蛋白質(zhì))，從臨床樣本中有效提取DNA并預(yù)濃縮對于后續(xù)程序(例如擴(kuò)增和檢測)非常重要。在甲基化DNA的情況下，這個問題更重要。

DNA甲基化在正常真核細(xì)胞中的基因表達(dá)調(diào)控和染色質(zhì)組織中起著至關(guān)重要的作用。DNA甲基化通過在胞嘧啶環(huán)的5-碳上共價添加甲基并產(chǎn)生5-甲基胞嘧啶而發(fā)生。這些甲基突出到DNA的主溝中并有效抑制轉(zhuǎn)錄。

在哺乳動物DNA中，在約4％的基因組DNA中發(fā)現(xiàn)5-甲基胞嘧啶，主要在胞嘧啶-鳥苷二核苷酸(CpG)中。這種CpG位點以低于人類總基因組中的預(yù)期頻率而發(fā)生，但更常見于稱為CpG島的小長度DNA中。

這些島通常存在于基因的啟動子區(qū)域(在此處轉(zhuǎn)錄起始)中或附近。與基因組DNA(其大部分在CpG位點處甲基化)不同，正常的體細(xì)胞啟動子和種系組織中的CpG島保持未甲基化，導(dǎo)致基因表達(dá)。

DNA甲基化由高度相關(guān)的一組DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)介導(dǎo)，DNMT將甲基從S-腺苷-L-甲硫氨酸轉(zhuǎn)移至CpG二核苷酸中的胞嘧啶。由DNMT建立的甲基胞嘧啶充當(dāng)MeCP2蛋白的甲基-CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域(MBD)，即MBD的結(jié)合位點。

MBD翻譯甲基化DNA染色質(zhì)環(huán)境，該甲基化DNA染色質(zhì)環(huán)境對轉(zhuǎn)錄具有壓抑性，并通過與組蛋白去乙?；?、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和ATP依賴性染色質(zhì)重塑酶的相互作用得以壓縮。特別地，MBD是MeCP2蛋白的甲基CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其結(jié)合至任意序列中對稱甲基化的CpG并參與介導(dǎo)甲基化依賴性轉(zhuǎn)錄抑制。盡管有強(qiáng)有力的證據(jù)表明MeCP2在體內(nèi)僅與甲基化的DNA片段結(jié)合，MeCP2在體外的DNA甲基化非依賴性結(jié)合活性也得到一致的記錄，該活性可以適當(dāng)?shù)赜糜谝话愕捏w外DNA分析。

最近，高純度純化核酸的使用在諸如生物技術(shù)、診斷醫(yī)學(xué)、藥物醫(yī)學(xué)和代謝醫(yī)學(xué)的各種領(lǐng)域中一直在增加，因此一直在努力更快速地并且更純地從各種生物樣品中分離核酸。

然而，到目前為止在分離核酸的方法中與載體相關(guān)的技術(shù)已經(jīng)發(fā)展得很好，所述載體從細(xì)胞裂解溶液中包含的各種物質(zhì)(例如基因組DNA、質(zhì)粒DNA、信使RNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞碎片顆粒)中僅特異性地吸附核酸，并且?guī)缀跛械难芯慷技性谖胶怂岬牟牧系难芯亢烷_發(fā)上。

因此，為了更快速且純地分離核酸，更需要開發(fā)能夠從細(xì)胞碎片顆粒、蛋白質(zhì)變性聚集體和各種其它細(xì)胞降解物質(zhì)中僅快速分離所需核酸的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問題

本發(fā)明的目的是提供一種提取核酸的方法及其設(shè)備，與使用所有需要大型設(shè)備(離心機(jī)和磁體等)的用于核酸提取的商品化試劑盒(包括傳統(tǒng)Qiagen)提取核酸的方法相比，該方法能夠簡單且低成本地從各種核酸來源中提取大量且高純度的核酸。

技術(shù)方案