[發明專利]允許更高光強度的利用時間相關單光子計數的熒光壽命成像顯微學方法

有效

• 申請號: 201780043767.4
• 申請日: 2017-05-24
• 公開（公告）號: CN109477796B
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發明（設計）人: V·塞弗里德;B·威茲高斯基;F·赫克特
• 申請（專利權）人: 徠卡顯微系統復合顯微鏡有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 王勇

一種利用時間相關單光子計數的熒光壽命成像顯微學方法，借助脈沖式光源(12)周期性地以激發光脈沖對樣品(36)進行激發以發射熒光光子，在每兩個相繼的激發光脈沖之間定義測量間隔；借助探測器(42)檢測熒光光子并且產生代表檢測到的熒光光子的模擬探測器信號；基于探測器信號確定探測時間，熒光光子在相應的測量間隔內在探測時間上被探測器(42)探測到；基于檢測到的熒光光子的探測時間，確定至少一個表征熒光衰減特性的參量，借助表征參量進行成像。在相應的測量間隔內在多個采樣間隔內對模擬探測器信號進行采樣并且將模擬探測器信號轉換成離散的配屬于各個采樣間隔的信號值的序列。借助屬于相應的測量間隔的離散信號值序列，確定在該測量間隔內是否檢測到多于預定數量的熒光光子，當多于時，放棄將該測量間隔用于確定表征參量。

技術領域

本發明涉及一種利用利用時間相關單光子計數的熒光壽命成像顯微學方法以及一種用于實施這樣的方法的顯微鏡。

背景技術

熒光壽命成像顯微學，簡稱FLIM(“fluorescence lifetime imagingmicroscopy”)是一種熒光顯微成像方法，該熒光顯微成像方法基于對熒光分子的激發態的不同壽命的測量。借助測得的壽命例如可以推斷出熒光分子的環境的特性，例如pH值、溫度、離子濃度、FRET轉移(熒光共振能量轉移)等。

熒光壽命可以直接在時間范圍內確定(“時域壽命測量”)或者在一種備選的方法中在頻率范圍內確定(“頻域壽命測量”)。在時間范圍內的確定可以根據所謂的時間相關單光子計數、簡稱TCSPC(“time correlated single photon counting”)的方法來實現。在該方法中，單個地檢測由于周期性地以激發光脈沖進行激發而釋放的光子。為此與此相應地需要能夠實現這樣的單光子檢測的探測器。所使用的激發光脈沖在此通常具有皮秒范圍內的脈沖持續時間，該脈沖持續時間明顯短于典型的處于納秒范圍內的熒光壽命。通常測量在激發光脈沖與緊接著其的由探測器檢測到熒光信號之間的時間。這樣所檢測的熒光光子然后經由多次測量而匯集成直方圖。在這樣的直方圖中繪出關于測得的時間的光子數量。以該方式通常能夠觀察到由檢測到的單光子所代表的熒光強度的與時間相關的指數型減少，由此確定熒光壽命。

此時，上述基于單光子計數的方法的問題在于，傳統的探測器緊接著在檢測到一個單個光子之后在一定的時間段上不再次準備好證實另一個光子。該時間段也稱為探測器的死區時間。傳統探測器的典型死區時間處于大約50納秒至100納秒的范圍內。因此，在所觀察的在兩個相繼的激發光脈沖之間定義的測量間隔內，通常限制于探測到的第一熒光光子。

由于僅觀察到在一個激發光脈沖之后相應出現的第一熒光光子，可能出現較小的時間份額在直方圖中的權重較高。該使測量結果錯誤的較高權重在專業圈內也稱為堆積效應。為了避免該堆積效應，典型地這樣調整入射的激發光脈沖的強度，使得每個激發光脈沖僅釋放1/10的光子。在該調整中存在如下可能性，即：對于每個激發光脈沖檢測兩個熒光光子，存在大約1％的可能性。然后可以忽略堆積效應。然而，這樣強烈減小激發光強度導致相應長的曝光時間，這又使得該方法難以廣泛應用。

為了解決以上所闡述的問題，在現有技術中存在一系列方案。一方面，在文獻DE10 2011 055 330 A1、DE 10 2011 055 945 A1和DE 10 2011 052 334 A1中這樣提出并行化分析電子裝置，使得從探測器信號獲取的數字數據序列被傳輸至能夠實現對數據序列的快速信息處理的串并轉換器。然而，分析電子裝置的該并行化在技術上是耗費的并且因此涉及巨大的成本。

在WO 2010/089363 A1中提出對堆積效應進行數值修正。然而，該數值修正以期望結果的模型為前提并且因此不能通用。