[發(fā)明專利]顯微鏡的光學(xué)路徑中蓋玻片的傾斜度測量和校正

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201780041024.3
• 申請日: 2017-06-29
• 公開（公告）號: CN109416461B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: J.西本摩根;T.卡爾克布倫納
• 申請（專利權(quán)）人: 卡爾蔡司顯微鏡有限責(zé)任公司
• 主分類號: G02B21/00
• 分類號: G02B21/00;G02B21/24;G02B21/36
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所 11105
• 代理人: 王蕊瑞

本發(fā)明涉及一種在顯微鏡(1)的光學(xué)路徑中調(diào)整樣品保持件(7)的方法，其中將照明輻射(BS)中的至少一個束指引到樣品保持件(7)上；通過檢測器(19)檢測由樣品保持件(7)反射的一部分照明輻射(BSref)并且確定檢測的照明輻射(BSref)的測量值；根據(jù)測量值，確定關(guān)于光學(xué)路徑的樣品保持件(7)的實際的目前位置；將確定的實際位置與期望的位置比較，并且產(chǎn)生用于修改實際的位置的控制命令，通過執(zhí)行該控制命令將樣品保持件(7)移動到期望的位置中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及在顯微鏡的束路徑中調(diào)整樣品保持件的方法。

背景技術(shù)

光片顯微術(shù)的主要應(yīng)用中的一個存在于以幾百μm上至若干毫米的尺寸來成像例如有機體的中型樣品。通常，這些樣品包埋在瓊脂糖中并且布置在玻璃毛細(xì)管中。出于檢查樣品的目的，將玻璃毛細(xì)管引入到充滿水的樣品室中并且將具有樣品的瓊脂糖按壓出毛細(xì)管一點。由光片照明樣品。通過檢測物鏡，將樣品中激發(fā)的并且從樣品發(fā)出的熒光成像到特別是照相機的檢測器上，該檢測物鏡垂直于光片并且因此還垂直于光片光學(xué)單元。

根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，光片顯微術(shù)的顯微鏡1的布局(SPIM布局、單平面照明顯微術(shù))包括照明物鏡2和檢測物鏡3(下面也稱為SPIM物鏡)，將照明物鏡2和檢測物鏡3各自從上方相對于樣品平面4以45°的角且關(guān)于彼此以直角指引到樣品平面4上(參見圖1A )。布置在樣品平面4上的樣品5位于例如實施為培養(yǎng)皿的樣品保持件7的基底上。用例如水的液體8填充樣品保持件7，并且在應(yīng)用光片顯微術(shù)期間將兩個SPIM物鏡2、3浸沒在液體8中(未示出)。樣品平面4延伸在由笛卡爾坐標(biāo)系中的X軸X和Y軸Y所跨越的 XY平面中。第一光軸A1和第二光軸A2延伸在由笛卡爾坐標(biāo)系中的Y軸Y 和Z軸Z所跨越的平面YZ中。

該方法提供了軸線方向上的高分辨的優(yōu)點，因為薄光片6可以通過照明物鏡2來產(chǎn)生。由于更高的分辨率，可以檢查更小的樣品5。此外，顯著地降低麻煩的背景熒光并且由此改進(jìn)信噪比。

根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，借助于通過位于樣品5下方的寬場物鏡20垂直穿過樣品保持件7的透明基底所記錄的寬場像，來產(chǎn)生與樣品平面4和樣品保持件 7平行的概覽像。發(fā)射的光對樣品5的照明并且捕獲該發(fā)射的光在此是不可能的，因為兩個SPIM物鏡2、3相對于彼此布置得太緊。

為了在諸如多孔板的標(biāo)準(zhǔn)樣品容器中促進(jìn)更簡易的樣品準(zhǔn)備，可以維持 45°配置但是具有倒置布置中的兩個SPIM物鏡2、3，將兩個SPIM物鏡2、 3從下方穿過樣品保持件7的透明基底指引到樣品平面4中(圖1B )。在這個布置中，必須通過使用特別的光學(xué)元件來校正由樣品保持件7引起的像差，該樣品保持件7相對于光軸A1和A2傾斜并且以蓋玻片的形式出現(xiàn)。穿過樣品保持件7的基底照明布置在樣品平面4中的樣品5，并且檢測樣品5的激發(fā)的熒光。可以使用諸如多孔板、培養(yǎng)皿和/或物體支撐件的樣品保持件7，并且特別地在高通量篩選的情況下可以避免樣品5的污染。

如果例如Alvarez板12布置在照明物鏡2和/或檢測物鏡3的束路徑中 (圖1B )，則其它技術(shù)難題發(fā)生(US 3305294 A)。Alvarez板12以它們校正像差的方式來實施，該像差可能恰好發(fā)生在例如蓋玻片的樣品保持件7和相應(yīng)的物鏡2、3的光軸A1、A2之間設(shè)定的角的情況下。導(dǎo)致較差圖像質(zhì)量的不需要的像差已經(jīng)發(fā)生在小角度偏離(例如＜0.1°)的情況下。因此，例如在實驗開始之前必須將蓋玻片對準(zhǔn)使得角度偏離位于可容許的公差內(nèi)。此外，有幫助的是，如果除了角度以外，在物鏡2、3之間的距離或者可能出現(xiàn)的附加的透鏡(例如彎月形透鏡)以及蓋玻片也是可調(diào)整的，使得樣品5或其將要成像的區(qū)域位于檢測物鏡3的像平面BE中。

DE 10 2007 046 601 A1公開了在反射的光系統(tǒng)中調(diào)整燈具的設(shè)備。至少一個孔徑光闌布置在所述反射的光系統(tǒng)中的反射的光照明束路徑中。檢測器布置在反射的光系統(tǒng)的檢測束路徑中。反射的光照明束路徑和檢測束路徑一起延伸并且在部分反射的光系統(tǒng)中平行。在部分反射的光系統(tǒng)中，光學(xué)元件是可定位的，隨著光學(xué)元件將孔徑光闌成像到檢測器上。