[發明專利]一步逆轉錄模板轉換PCR

在審

• 申請號: 201780037392.0
• 申請日: 2017-06-23
• 公開（公告）號: CN109328235A
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 城口克之
• 申請（專利權）人: 國立研究開發法人理化學研究所
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 北京派特恩知識產權代理有限公司 11270
• 代理人: 王子曄;姚開麗

1.一種擴增靶RNA的至少一部分區域的方法，所述方法包括以下步驟：

a)混合所述靶RNA、逆轉錄所需的試劑、模板轉換所需的試劑和聚合酶鏈反應所需的試劑，并使混合物經歷發生逆轉錄的條件以提供cDNA，所述cDNA包含模板轉換寡核苷酸以及與所述靶RNA對應的核酸序列；和

b)使步驟a)中獲得的所述cDNA經歷發生聚合酶鏈反應的條件，以擴增所述cDNA的至少一部分區域；

其中，所述聚合酶鏈式反應所需的試劑包含經修飾的寡核苷酸引物，所述經修飾的寡核苷酸引物設計成在步驟a)中引物功能部分地封閉或完全地封閉，并設計成在步驟b)中清除引物功能的封閉。

2.一種產生基于靶RNA的至少一部分區域擴增的核酸樣品的方法，所述方法包括以下步驟：

a)混合所述靶RNA、逆轉錄所需的試劑、模板轉換所需的試劑和聚合酶鏈反應所需的試劑，并使混合物經歷發生逆轉錄的條件以提供cDNA，所述cDNA包含模板轉換寡核苷酸以及與所述靶RNA對應的核酸序列；和

b)使步驟a)中獲得的所述cDNA經歷發生聚合酶鏈反應的條件；

其中，所述聚合酶鏈式反應所需的試劑包含經修飾的寡核苷酸引物，所述經修飾的寡核苷酸引物設計成在步驟a)中引物功能部分地封閉或完全地封閉，并設計成在步驟b)中清除引物功能的封閉。

3.權利要求1或2所述的方法，其中，所述聚合酶鏈反應所需的試劑根據需要包含5'錨定寡核苷酸引物，所述5'錨定寡核苷酸引物含所述模板轉換寡核苷酸中所包含的錨定序列的至少一部分。

4.權利要求3所述的方法，其中，所述聚合酶鏈反應所需的試劑不包含所述5'錨定寡核苷酸引物。

5.權利要求1-4中任一項所述的方法，其中，所述逆轉錄所需的試劑包含使逆轉錄開始的寡核苷酸引物，并且所述使逆轉錄開始的寡核苷酸引物以約40nM以下的終濃度，或相對于所述經修飾的寡核苷酸引物約10分之1以下的摩爾比包含在所述混合物中。

6.權利要求1-5中任一項所述的方法，其中，所述經修飾的寡核苷酸引物在同一經修飾的寡核苷酸引物的序列上具有一個或更多個互補區域，并且在PCR的初期熱變性之前通過所述互補區域具有轉角結構，或包含不耐熱的修飾基團。

7.權利要求1-6中任一項所述的方法，其中，所述經修飾的寡核苷酸引物包含與模板RNA的一部分序列互補的核苷酸序列。

8.權利要求7所述的方法，其中，引物功能尚未被封閉的一部分的所述經修飾的寡核苷酸引物起到通過與所述模板RNA雜交而使逆轉錄開始的寡核苷酸引物的作用。

9.用于擴增靶RNA的至少一部分區域的試劑盒，所述試劑盒包括：

i)逆轉錄所需的試劑；

ii)模板轉換所需的試劑；

iii)使用經修飾的寡核苷酸引物進行聚合酶鏈反應所需的試劑；和

iv)根據需要，用戶手冊；

其特征在于，在反應開始時，將所述i)至iii)的試劑和所述經修飾的寡核苷酸引物全部混合在反應體系中，所述經修飾的寡核苷酸引物設計成在發生逆轉錄的條件下引物功能部分地封閉或完全地封閉，并設計成在發生聚合酶鏈反應的條件下清除引物功能的封閉。

10.權利要求9所述的試劑盒，其中，所述模板轉換所需的試劑包含模板轉換寡核苷酸，并且所述聚合酶鏈反應所需的試劑根據需要包含5'錨定寡核苷酸引物，所述5'錨定寡核苷酸引物含所述模板轉換寡核苷酸中所包含的錨定序列的至少一部分。

11.權利要求10所述的試劑盒，其中，所述聚合酶鏈式反應所需的試劑不包含5'錨定寡核苷酸引物。