[發明專利]用于適配子對選擇的方法

在審

• 申請號: 201780036344.X
• 申請日: 2017-06-16
• 公開（公告）號: CN109661466A
• 公開（公告）日: 2019-04-19
• 發明（設計）人: 金俊烈
• 申請（專利權）人: 普羅克斯米蒂生物學有限責任公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 成都超凡明遠知識產權代理有限公司 51258
• 代理人: 魏彥

已經開發了用于在自由溶液中選擇針對靶點分子的單個或多個適配子對的方法。這些方法利用新的協同進化途徑來選擇針對一個或多個靶點的適配子對，其中在靶點結合時一個或多個適配子的配對觸發適配子可擴增性。以這種方式，通過一輪或多輪選擇過程的適配子配體的富集主要基于自由溶液中適配子的靶點驅動的緊密接近。使用陽性或陰性選擇方法將靶點結合和富集偶聯。這些技術通常應適用于許多不同類型的靶點分子，為分析、制備和治療目的提供抗體、藥物或其他結合分子的替代物。

相關申請的交叉引用

本申請要求2016年6月17日提交的美國臨時申請序列號62/351,890的優先權的權益，其內容通過引用并入本文。

技術領域

本發明涉及用于從隨機化寡核苷酸文庫開始獲得對于目標靶點有選擇性的成對寡核苷酸適配子的方法、試劑和試劑盒。

背景技術

適配子是小的人工配體，包括能夠以高親和力結合特定目標靶點部分的單鏈DNA、RNA或多肽分子。約二十五年來，適配子一直被認為是抗體的潛在替代物，用于作為診斷和/或治療目的使用。適配子通常由通過基于親和力的針對目標靶點的分配篩選候選寡核苷酸的隨機文庫而獲得。適配子在寬的pH和溫度范圍內具有高的結構穩定性，使其成為用于廣譜的體外、離體和體內應用的理想試劑。

在1990年，Tuerk等,1990(Science 249,505-510)和Ellington 1990(Nature346,818-822,doi:10.1038/346818a0)開發了模擬進化過程的體外方法。該過程被稱為指數富集的配體系統進化(SELEX)。SELEX過程利用進化的基本概念，運用變異、選擇和復制以從核酸分子(即寡核苷酸)的起始庫獲得高靶點親和力和特異性。通常，為了選擇核酸(寡核苷酸DNA或RNA)適配子，通過合成在從約20至約100個核苷酸的大小范圍內的短寡核苷酸文庫(約10¹⁴個不同序列)來實現變異。每個寡核苷酸包括側翼為引物區域的內部隨機區域，用于隨后通過合適的擴增反應擴增，例如用于DNA的聚合酶鏈式反應(PCR)，或用于RNA的逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。由于文庫中大數量的獨特序列，至少一些適配子分子以特異性和親和力結合靶點的可能性很高。接下來，通過將核酸庫與固定在珠上的靶點分子一起溫育，然后洗去非結合序列來實現選擇。結合的適配子分子被洗脫并且擴增，形成用于下一輪SELEX的輸入。通過使用PCR或一些其他擴增方法擴增結合的寡核苷酸來實現復制。然后將從一輪SELEX獲得的寡核苷酸庫(即選擇后擴增)用作用于下一輪SELEX的輸入，直到一組寡核苷酸(即核酸適配子)被富集，其緊密并且特異性地結合至靶點分子。最近在隨機文庫的制備以及在基于親和力的分配中的技術進步使得適配子具有與抗體等同的親和力。

該技術已應用于針對無機組分、小有機分子(Ellington,等,1990,Nature346,818-822,doi:10.1038/346818a0)、核苷酸(Sassanfar 1993,Nature 5；364(6437):550-3)、輔因子(Lorsch 1994,Biochemistry,33(4):973-82)、核酸(Boiziau,等,1999,J BiolChem.30；274(18):12730-7)、氨基酸(Majerfeld等,2005J Mol Evol.61(2):226-35)、碳水化合物(Jeong等,2001,Biochem Biophys Res Commun.16；281(1):237-43)、抗生素(Wang1996,Biochemistry,35(38):12338-46.)、肽(Ylera等,2002,.Biochem Biophys ResCommun290(5):1583-8)、蛋白質(Tuerk,1990同上)以及甚至結構復雜，諸如細胞(Shangguan等,2006Proc Natl Acad Sci USA.103(32):11838-43)來選擇DNA或RNA適配子。

適配子優于抗體的優點有容易體外合成、修飾靈活、靶點范圍廣泛、可重復使用性和熱/化學穩定性高。非免疫原性和解毒劑的可用性增加了適配子作為治療藥物的價值。