[發明專利]Lp-PLA2活性的測定

有效

• 申請號: 201780034627.0
• 申請日: 2017-06-15
• 公開（公告）號: CN109563536B
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: 酒瀬川信一;山浦沙樹;杉森大助
• 申請（專利權）人: 旭化成制藥株式會社
• 主分類號: C12Q1/44
• 分類號: C12Q1/44;C12N9/16
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司 11127
• 代理人: 龐東成;李洋

1.一種酶的應用，其用于在下述通式I所示的血小板活化因子類即PAF類和下述通式II所示的Lyso PAF類的存在下，不進行將所述PAF類水解而生成膽堿的反應，而將所述LysoPAF類水解而生成膽堿，

【化1】

式I中，

R¹為直鏈或支鏈的飽和或部分不飽和的高級烴基，

R²為直鏈的低級烷基，

X為-C(O)-或-CH₂-，

【化2】

式II中，

R¹和X與通式I中的定義相同，

所述酶為以下的(a)和(b)中的任一者中記載的蛋白質：

(a)具有序列號1或9中記載的氨基酸序列的蛋白質；

(b)具有在序列號1或9中記載的氨基酸序列中發生了氨基酸置換的氨基酸序列，不具有針對PAF的磷脂酶D樣活性即PLD活性，并且具有針對Lyso PAF的PLD活性的蛋白質，所述置換為：

序列號1中第71位或序列號9中第45位的氨基酸M置換為氨基酸G、A、L或D；或

序列號1中第283位或序列號9中第257位的氨基酸F置換為氨基酸G、E、R、K或W。

2.一種活性的測定方法，其用于非診斷目的，其測定包含脂蛋白相關磷脂酶A2即Lp-PLA₂的試樣中的Lp-PLA₂活性，該測定方法包括以下的工序(A)～工序(C)：

(A)使下述通式I所示的血小板活化因子類即PAF類與試樣中的Lp-PLA₂反應而轉換為下述通式II所示的Lyso PAF類的工序，

【化3】

式I中，

R¹為直鏈或支鏈的飽和或部分不飽和的高級烴基，

R²為直鏈的低級烷基，

X為-C(O)-或-CH₂-，

【化4】

式II中，

R¹和X與通式I中的定義相同；

(B)利用酶將工序(A)中生成的所述Lyso PAF類水解而得到水解物的工序，所述酶為以下的(a)和(b)中的任一者中記載的蛋白質：

(a)具有序列號1或9中記載的氨基酸序列的蛋白質，

(b)具有在序列號1或9中記載的氨基酸序列中發生了氨基酸置換的氨基酸序列，不具有針對PAF的磷脂酶D樣活性即PLD活性，并且具有針對Lyso PAF的PLD活性的蛋白質，所述置換為：

序列號1中第71位或序列號9中第45位的氨基酸M置換為氨基酸G、A、L或D；或

序列號1中第283位或序列號9中第257位的氨基酸F置換為氨基酸G、E、R、K或W；

(C)對于工序(B)中得到的水解物，以來自該水解物的變化量為指標，對試樣中的Lp-PLA₂活性進行測定的工序。

3.如權利要求2所述的方法，其中，工序(C)中的變化量是作為水解物的膽堿的變化量。

4.如權利要求3所述的方法，其中，作為測定膽堿的變化量的方法，工序(C)進一步包括下述的工序(C-1)：

(C-1)使膽堿與膽堿氧化酶反應而生成過氧化氫的工序。

5.如權利要求4所述的方法，其中，工序(C)進一步包括下述的工序(C-2)：

(C-2)通過使用顯色試劑的比色分析法，對工序(C-1)中生成的過氧化氫的量進行測定的工序。

6.如權利要求2～5中任一項所述的方法，其中，在工序(A)之前進一步包括下述的工序(D)：

(D)將試樣中的膽堿除去的工序。

7.如權利要求6所述的方法，其中，工序(D)是使用膽堿氧化酶將試樣中的膽堿除去的工序。

8.如權利要求2～5、7中任一項所述的方法，其中，R²為甲基。