[發明專利]無細胞生成核糖核酸

在審

• 申請號: 201780033464.4
• 申請日: 2017-04-06
• 公開（公告）號: CN109196109A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: W.J.布萊克;D.S.康寧漢姆;D.麥凱克倫;J.R.阿布希爾;M.古普塔
• 申請（專利權）人: 綠光生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12N1/06;C12N1/20
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 張文輝

1.生物合成核糖核酸(RNA)的無細胞方法，所述方法包括：

(a)在導致RNA解聚的條件下，溫育包含RNA和至少一種酶活性的細胞裂解物混合物以產生包含一磷酸核苷的細胞裂解物混合物，所述酶活性選自下組：解聚RNA的酶活性、熱穩定性激酶活性和熱穩定性RNA聚合酶活性；

(b)將步驟(a)中產生的所述細胞裂解物混合物加熱至使內源核酸酶和磷酸酶失活或部分失活而不使熱穩定性激酶活性和熱穩定性RNA聚合酶活性完全失活的溫度，以產生包含熱失活的核酸酶和磷酸酶的細胞裂解物混合物；和

(c)在能量源和編碼感興趣RNA的脫氧核糖核酸(DNA)模板存在下，在導致三磷酸核苷產生和三磷酸核苷聚合的條件下，溫育(b)中產生的所述細胞裂解物混合物以產生包含所述感興趣RNA的細胞裂解物混合物。

2.權利要求1的方法，其中所述細胞裂解物混合物包含從細胞獲得的單細胞裂解物，所述細胞包含RNA并且表達至少一種充當核糖核酸酶、充當激酶、和/或充當RNA聚合酶的酶或融合酶。

3.權利要求1的方法，其中所述細胞裂解物混合物包含至少兩種細胞裂解物，其中至少一種細胞裂解物獲自包含RNA的細胞，并且至少一種細胞裂解物獲自表達至少一種充當核酸酶、充當激酶、和/或充當RNA聚合酶的酶或融合酶的細胞。

4.權利要求1-3中任一項的方法，其中步驟(a)的RNA是信使RNA(mRNA)、轉移RNA(tRNA)或核糖體RNA(rRNA)。

5.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述細胞裂解物混合物包含至少一種核糖核酸酶、至少一種熱穩定性激酶和/或至少一種熱穩定性RNA聚合酶。

6.權利要求5的方法，其中所述至少一種核糖核酸酶選自S1核酸酶、核酸酶P1、RNA酶II、RNA酶III、RNA酶R、RNA酶JI、NucA、PNP酶、RNA酶T、RNA酶E和RNA酶G。

7.權利要求6的方法，其中所述至少一種核糖核酸酶是大腸桿菌RNA酶R。

8.權利要求5-7中任一項的方法，其中所述至少一種熱穩定性激酶選自熱穩定性一磷酸核苷激酶、熱穩定性二磷酸核苷激酶和熱穩定性多磷酸激酶。

9.權利要求8的方法，其中所述熱穩定性一磷酸核苷激酶選自熱穩定性尿苷酸激酶、熱穩定性胞苷酸激酶、熱穩定性鳥苷酸激酶和熱穩定性腺苷酸激酶。

10.權利要求9的方法，其中所述熱穩定性一磷酸核苷激酶選自下組：由pyrH基因(PfPyrH)編碼的熱穩定性激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)尿苷酸激酶、由adk基因(TthAdk)編碼的熱穩定性嗜熱棲熱袍菌(Thermus thermophilus)腺苷酸激酶、由cmk基因(TthCmk)編碼的熱穩定性嗜熱棲熱袍菌胞苷酸激酶和由gmk基因(TmGmk)編碼的熱穩定性海洋棲熱袍菌(Thermotoga maritima)鳥苷酸激酶。

11.權利要求8-10中任一項的方法，其中所述熱穩定性二磷酸核苷激酶選自下組：由風產液菌(Aquifex aeolicus)ndk基因編碼的熱穩定性二磷酸核苷激酶。

12.權利要求8-10中任一項的方法，其中所述熱穩定性多磷酸激酶選自下組：熱穩定性多磷酸激酶1(PPK1)酶和熱穩定性多磷酸激酶2(PPK2)酶。

13.權利要求12的方法，其中所述熱穩定性PPK1酶選自下組：熱穩定性伸長熱聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)PPK1酶。

14.權利要求12或13的方法，其中所述熱穩定性PPK2酶選自下組：熱穩定性III類PPK2酶。