[發明專利]確定細胞培養物的感染部位的數量的方法

有效

• 申請號: 201780032666.7
• 申請日: 2017-05-24
• 公開（公告）號: CN109313191B
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發明（設計）人: 諾貝特·加爾博
• 申請（專利權）人: 珀金埃爾默細胞科技德國公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 北京銀龍知識產權代理有限公司 11243
• 代理人: 鐘海勝;宋琴芝

本發明涉及一種確定細胞培養物的感染部位的數量的方法，包括以下步驟：用病毒感染在樣品載體中布置的細胞培養物，通過透射光方法對所述細胞培養物的任何感染區域計數，用熒光標記物標記感染細胞，通過熒光分析方法對細胞培養物的感染區域計數，以及逐個區域地評估兩種方法中所確定的區域，以確定感染部位的數量。

本發明涉及一種確定細胞培養物的感染部位的數量的方法。

為了確定細胞培養物的感染部位的數量，已知首先使細胞培養物在樣品載體上生長。合適的樣品載體特別是滴定板和微量滴定板，其中細胞培養物在單獨的孔中生長，使得細胞可附著于孔底。此后，用病毒液感染細胞。通常病毒液是稀釋的，將不同稀釋度的病毒液添加到不同的孔中。在預定的時間段(特別取決于病毒的類型)之后，移除病毒液，特別是抽出病毒液。病毒液通常作用于細胞培養物數分鐘至數小時。移除病毒液后，通常提供培養基以防止稍后釋放的病毒顆粒擴散。特別是作為凝膠層引入的這種培養基，用于覆蓋細胞培養物。此后，通常進行數天的較長時間的等待。在此期間，受感染的細胞死亡，從中出現的病毒擴散到相鄰的細胞中。由此形成相對大的區域，其中死亡細胞不再可見并且被具有仍然存活但已經被感染的細胞的區域包圍。在這里，感染部位被定義為樣品載體上已經發生病毒初次感染細胞的區域，其中，從相應的感染部位開始，形成其中細胞已經被感染和/或已經被破壞的感染區域。

使用透射光方法，可以對破壞的區域或沒有活細胞的區域計數。這種計數通常在由人、攝像或顯微鏡拍攝相應圖像之后進行。如果有必要，可以用染料使樣品染色以增加對比度。合適的，特別是非特異性的染料(例如亞甲藍)標記活細胞，使得沒有活細胞存在的區域對于觀察者來說更明顯是孔。

通過透射光方法確定細胞培養物的感染部位的數量尤其具有以下缺點：例如，稍后感染的細胞或以不同方式與病毒反應的細胞尚未死亡，因此，使用透射光方法沒有看到相應的孔。該缺點也適用于例如反應更慢的細胞，這使得相應的孔仍然非常小，因此是不可見或難以看見。透射光方法的另一個缺點是，不是由病毒引起的其他空洞被檢測為這樣的空洞并且被錯誤地包括在計數中。這種空洞可以是例如細胞被洗掉或存在污染的區域。例如，當添加病毒液或添加凝膠時，可以被洗掉。此外，在相應地執行透射光方法之前所必須等待的時間段的持續時間難以確定，并且這特別取決于病毒的類型。如果時間太短，則相應的感染區域僅具有少量死亡細胞，從而難以辨別相應的孔或空洞。如果時間太長，則各個區域變得融合，從而難以確定最初只有一個感染部位，還是多個具有細胞培養物的共同感染區域的感染部位。

此外，為了確定細胞培養物的感染部位的數量，已知用特別是標記感染細胞的病毒特異性熒光標記物來處理細胞培養物。然后由于相應區域發出熒光，可以計算感染區域。然而，該方法的缺點在于，相鄰的感染區域不能彼此辨別，因此只能被錯誤地檢測為一個原始感染部位。

本發明的目的是提供一種確定細胞培養物的感染部位的數量的方法，利用該方法可以更準確和更可靠地確定感染部位的數量。

根據本發明，該目的通過如權利要求1所限定的方法實現。

在本發明提供的用于確定細胞培養物中感染部位的數量的方法中，首先用病毒感染在樣品載體中布置的細胞培養物。這尤其通過添加(如果需要)可以稀釋的病毒液來完成。在這里，感染部位被定義為樣品載體上已經發生病毒初次感染細胞的區域，其中，從感染的各個部位開始，形成其中細胞已經被感染和/或已經被破壞的感染區域。優選使用滴定板，特別是微量滴定板作為樣品載體，細胞培養物優選在孔底部生長。

在下一步驟中，已知的透射光方法用于確定可能感染的區域，該區域中由于病毒感染破壞細胞而已經在細胞培養物中形成孔。因此，使用透射光方法，確定不存在活細胞的所有區域。因此，確定相應的空洞或孔。在這樣做時，特別是不僅確定了細胞由于病毒細胞已經死亡的區域，而且還確定了由于污染或因為細胞已經被洗掉而不包含活細胞的區域。