[發(fā)明專利]生物樣本中游離核酸的保存

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201780032586.1
• 申請日: 2017-05-16
• 公開（公告）號: CN109153992B
• 公開（公告）日: 2022-11-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 塔哈·亞歷山大·哈吉·阿哈默德;尤瑟夫·哈吉·阿哈默德
• 申請（專利權(quán)）人: 諾根生物科技公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N1/04;C12Q1/686;C12Q1/6869
• 代理公司: 華進聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 黃愛嬌

提供了一種用于保存生物樣本中的游離核酸和/或細胞的組合物及其使用方法。該組合物包括至少一種可排除體積的聚合物、至少一種滲透劑和至少一種酶抑制劑。該組合物任選還包括至少一種代謝抑制劑。此外，提供了一種優(yōu)選包含在采血管中的含有該組合物或組合物的組分的試劑盒。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于保存生物樣本中游離核酸的組合物、方法和試劑盒，特別是分離自血液或血漿樣本中的游離DNA。

背景技術(shù)

眾所周知，游離DNA(cfDNA)可以在血流中循環(huán)。cfDNA可以通過新合成核酸的主動釋放進入血流中，或者可以由壞死和/或凋亡細胞的死亡產(chǎn)生。cfDNA片段的大小通常小于200bp(McLarty LJ,Yeh CH.2015.“循環(huán)游離DNA：癌癥管理中的血液活檢”.MOJ CellScienceReport 2[2]:00021)。雖然血流中的cfDNA是最常研究的，但在其他體液中也存在cfDNA，包括唾液和尿液。

最近的研究已經(jīng)開始關(guān)注cfDNA在非侵入性診斷應(yīng)用中的用途。存在于癌癥患者中的cfDNA濃度升高，并且腫瘤特異性cfDNA與許多不同的癌癥相關(guān)，包括血癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌和宮頸癌(McLarty等人(2015))。有強有力的證據(jù)表明，cfDNA可用作非侵入性生物標(biāo)志物來診斷癌癥、監(jiān)測疾病進展并監(jiān)測某些個體的治療反應(yīng)。

此外，人們對使用cfDNA在非侵入性產(chǎn)前檢測(NIPT)中的用途感興趣，因為在母體血漿中存在游離胎兒DNA(Lo YM等人，“胎兒DNA在母體血漿和血清中的存在”.Lancet1997；350:485-487)。目前，研究人員正在研究使用游離胎兒DNA進行胎兒性別測定、在RhD陰性母親中進行胎兒恒河猴D(RhD)基因分型以及診斷某些遺傳病癥，例如軟骨發(fā)育不全和非整倍體(Everett TR,Chitty LS.“游離胎兒DNA：胎兒醫(yī)學(xué)的新工具”.UltrasoundObstet Gynecol 2015；45:499-507)。

在診斷應(yīng)用中使用cfDNA(例如血漿cfDNA)的挑戰(zhàn)是檢測目標(biāo)cfDNA，因為它們存在量極低。例如，在孕婦中，大部分血漿cfDNA是母體的，只有約10％的cfDNA構(gòu)成游離胎兒DNA(Lunn FM,Chiu RW,Allen Chan KC,Yeung Leung T,Kin Lau T,Denis Lo YM.“微流體數(shù)字PCR顯示母體血漿中胎兒DNA的比例高于預(yù)期部分”.Clin Chem 2008；54:1664-1672)。類似地，在癌癥患者中存在的腫瘤相關(guān)血漿cfDNA的量通常小于總cfDNA的10％(Norton SE等人.“如數(shù)字PCR所確定的，穩(wěn)定劑在血液樣本儲存和運輸期間防止血漿中細胞DNA的游離DNA污染”.Clinical Biochemistry 46(2013)1561-1565)。這些數(shù)字對應(yīng)于極低量，因為健康個體中總的循環(huán)cfDNA的平均濃度僅為10-30ng/mL。

在診斷應(yīng)用中使用cfDNA的另一個挑戰(zhàn)是樣本采集后血漿cfDNA被基因組DNA(例如，母體或非腫瘤)污染，這是由于在儲存和運輸樣本期間白細胞的裂解以及由此導(dǎo)致的基因組DNA(gDNA)釋放到血漿部分。由于存在于血漿中的總cfDNA的量已經(jīng)非常低，并且目標(biāo)cfDNA的量僅是存在的cfDNA的一部分，因此這種gDNA的釋放將干擾下游應(yīng)用中目標(biāo)cfDNA的檢測。

防止gDNA釋放到血漿部分中的常用方法是將血液采集到標(biāo)準(zhǔn)EDTA或檸檬酸鈉管中，然后冷藏血液樣本并通過離心在6小時內(nèi)制備血漿。一旦血漿制備好，就必須在DNA分離之前將其冷凍。然而，該方法的一個問題是大多數(shù)采血站沒有將血漿從血液樣本中分離所需的設(shè)備，因此必須將樣本運送到中心實驗室或核心設(shè)施進行血漿處理和后續(xù)DNA分離。此外，即使該站點確實具有制備血漿的能力，在DNA分離和下游診斷應(yīng)用之前也必須將其冷凍。因此，使用標(biāo)準(zhǔn)EDTA或檸檬酸鈉管對于cfDNA在診斷應(yīng)用中的廣泛使用并不理想或不實用，特別是對于資源有限的實驗室和地區(qū)，缺乏在運輸前立即制備血漿和冷凍儲存所需的設(shè)備。