[發明專利]生物樣品中磷酸化和非磷化形式的RKIP的定量評估方法

有效

• 申請號: 201780028383.5
• 申請日: 2017-03-21
• 公開（公告）號: CN109154612B
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: M·帕帕萊
• 申請（專利權）人: 弗露迪亞有限責任公司
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574
• 代理公司: 中國貿促會專利商標事務所有限公司 11038
• 代理人: 張小勇

1.用于生物樣品中RKIP蛋白和p-RKIP蛋白的定量測量的方法，其包括以下步驟：

a)將下述a1)和a2)共同作用于兩種不同的支持物：

a1)識別存在于p-RKIP蛋白中的第一氨基酸序列的抗體，和

a2)識別存在于RKIP蛋白中的第一氨基酸序列的抗體；

b)向所述兩種支持物添加封閉溶液，

c)添加所述生物樣品；

d)在各個支持物中添加：

d1)識別存在于p-RKIP蛋白中的第二氨基酸序列的抗體，和

d2)識別存在于RKIP蛋白中的第二氨基酸序列的抗體；

所述第一和第二氨基酸序列之一在RKIP和p-RKIP之間是共同的，而另一個是含有磷酸化的絲氨酸153的序列，因此對于p-RKIP和RKIP是不同的；

e)添加當與識別所述第二氨基酸序列的所述抗體接觸時，能夠確定與結合所述第二氨基酸序列的所述抗體的量成比例的光學性質變化的標記物；

f)測量兩種樣品的光學性質，并將其與通過測量兩個系列的支持物的相同光學性質獲得的校準曲線進行比較，在所述兩個系列的支持物中已經順序添加了：

i)識別所述系列中第一個的存在于p-RKIP蛋白中的所述第一氨基酸序列和所述系列中第二個的存在于RKIP蛋白中的所述第一氨基酸序列的抗體；

ii)封閉溶液；

iii)已知和增加量的重組雜合標準品，其包含所述系列中第一個的存在于p-RKIP蛋白中的所述第一和第二氨基酸序列和所述系列中第二個的存在于RKIP蛋白中的所述第一和第二氨基酸序列；

iv)分別特異性識別存在于p-RKIP中的所述第二氨基酸序列或存在于RKIP中的所述第二序列的抗體；

v)當與識別所述第二氨基酸序列的所述抗體接觸時，能夠確定與結合所述第二氨基酸序列的所述抗體的量成比例的光學性質變化的標記物。

2.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述包含存在于p-RKIP蛋白中的所述第一和第二氨基酸序列的重組雜合標準品具有以下報告的氨基酸序列：

DPDAPSRKDPKYRE-(接頭)-GDHRGKFKVApSFRKKYELRA。

3.根據權利要求1或2的方法，其特征在于，所述包含存在于RKIP蛋白中的所述第一和第二氨基酸序列的重組雜合標準品具有以下報告的氨基酸序列：

DPDAPSRKDPKYRE-(接頭)-GDHRGKFKVASFRKKYELRA。

4.根據權利要求3的方法，其特征在于，存在于RKIP中的所述第一序列和存在于p-RKIP中的所述第一序列均等同于以下報告的序列：DPDAPSRKDPKYRE。

5.根據權利要求4的方法，其特征在于，存在于RKIP中的所述第二序列為如下：

GDHRGKFKVASFRKKYELRA

而存在于p-RKIP中的所述第二序列為如下：

GDHRGKFKVApSFRKKYELRA。

6.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述支持物是ELISA微量滴定板的孔，在步驟d)之后引入以下步驟：

d3)在各個支持物中添加對識別所述第二氨基酸序列的所述抗體特異的HRP綴合的抗體，

并且在步驟iv)之后，向所述系列的孔添加對識別所述第二氨基酸序列的抗體特異的HRP綴合的抗體，

并且當與識別所述第二氨基酸序列的所述抗體接觸時能夠確定光學性質變化的所述標記物是TMB，并且所述光學性質是光密度。

7.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述支持物是色譜盒，

所述生物樣品被添加到盒的一端，

識別所述第一氨基酸序列的所述抗體共同作用于所述盒的遠離吸收紙的區域中，

并且識別所述第二氨基酸序列的所述抗體粘附到靠近吸收紙的區域中的所述盒的色譜表面，

并且當與識別所述第二氨基酸序列的所述抗體接觸時能夠確定光學性質變化的所述標記物是熒光探針，并且所述光學性質是特定波長的熒光。

8.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述生物樣品是尿液、血清、血漿、唾液、支氣管肺泡液、腦脊液、糞便、精液、細胞或組織蛋白提取物或細胞培養基中的一種。