[發(fā)明專利]用于生產(chǎn)分泌蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201780024313.2
• 申請日: 2017-02-10
• 公開（公告）號: CN109072236B
• 公開（公告）日: 2022-06-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: M·奧拉耶耶;A·豪塞爾;L·皮珀;M·斯特羅貝克;T·文格爾
• 申請（專利權(quán)）人: 勃林格殷格翰國際公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12P21/00;C12N1/00
• 代理公司: 永新專利商標(biāo)代理有限公司 72002
• 代理人: 左路;區(qū)斌

1.一種具有重組治療蛋白質(zhì)的增強(qiáng)分泌的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其包括(a)宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)TBC1結(jié)構(gòu)域家族成員20(TBC1D20)和神經(jīng)酰胺合酶2(CERS2)的降低表達(dá)；或(b)宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)激活轉(zhuǎn)錄因子6β(ATF6B)的降低表達(dá)，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼重組分泌性治療蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒，其中(a)編碼所述宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的基因包含抑制所述宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)的遺傳修飾，或(b)所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包含通過RNA干擾抑制編碼所述宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的基因表達(dá)的RNA寡核苷酸，和其中與不含有所述遺傳修飾或RNA寡核苷酸的相同哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞中TBC1D20和CERS2的蛋白質(zhì)表達(dá)或ATF6B的蛋白質(zhì)表達(dá)降低。

2.一種具有重組治療蛋白質(zhì)的增強(qiáng)分泌的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其包括宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)TBC1D20和CERS2的降低表達(dá)，其中(a)編碼所述宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的基因包含抑制所述宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)的遺傳修飾，或(b)所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包含通過RNA干擾抑制編碼所述宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的基因表達(dá)的RNA寡核苷酸，和其中與不含有所述遺傳修飾或RNA寡核苷酸的相同哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞中TBC1D20和CERS2的蛋白質(zhì)表達(dá)降低，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼重組分泌性治療蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒。

3.一種產(chǎn)生具有重組治療蛋白質(zhì)的增強(qiáng)分泌的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的非治療方法，其包括：(a)通過以下降低所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞中宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)TBC1D20和CERS2或宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)ATF6B的表達(dá)：(i)將遺傳修飾引入編碼所述宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的基因內(nèi)，所述遺傳修飾抑制所述宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的表達(dá)，或(ii)將RNA寡核苷酸引入所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，所述RNA寡核苷酸通過RNA干擾抑制編碼所述宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)，和(b)引入編碼重組分泌性治療蛋白質(zhì)的一種或多種基因，其中與不含有所述遺傳修飾或RNA寡核苷酸的相同哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞中TBC1D20和CERS2的蛋白質(zhì)表達(dá)或ATF6B的蛋白質(zhì)表達(dá)降低。

4.權(quán)利要求3的方法，其進(jìn)一步包括下述步驟：(c)選擇具有重組治療蛋白質(zhì)的增強(qiáng)分泌的細(xì)胞；和(d)任選地在允許編碼重組分泌性治療蛋白質(zhì)的一種或多種基因表達(dá)的條件下，培養(yǎng)步驟(c)中獲得的所述細(xì)胞。

5.權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或權(quán)利要求3至4中任一項(xiàng)的方法，其中所述RNA干擾由短發(fā)夾RNA(shRNA)或小干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)。

6.權(quán)利要求5的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞用一種或多種表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，所述表達(dá)載體包含編碼所述siRNA或shRNA的核苷酸序列，并且任選地其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞用一種或多種表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，所述表達(dá)載體包含編碼所述siRNA或shRNA的核苷酸序列。

7.權(quán)利要求5的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或方法，其中(i)所述siRNA是(a)如SEQ ID NO：7所示的siTbc1D20#1、或如SEQ ID NO：8所示的siCerS2#1、或其組合；或(b)如SEQ ID NO：9所示的siAtf6b#1、如SEQ ID NO：10所示的siAtf6b#2和如SEQ ID NO：11所示的siAtf6b#3中的一種或多種；或(ii)所述shRNA包含(a)如SEQ ID NO：12所示的shTbc1D20#1、或如SEQ ID NO：13所示的shCerS2#1和如SEQ ID NO：14所示的shCerS2#2中的一種或多種、或其組合；或(b)如SEQ ID NO：15所示的shAtf6b#1和如SEQ ID NO：37所示的shAtf6b#2中的一種或多種。

8.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或權(quán)利要求3至4中任一項(xiàng)的方法，其中編碼所述宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)TBC1D20和CERS2或ATF6B的基因中的遺傳修飾獨(dú)立地是(a)基因缺失；或(b)基因中的突變，其抑制所述宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)。