[發(fā)明專利]一種頭孢菌素C酰化酶突變體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201780023015.1
• 申請日: 2017-03-15
• 公開（公告）號: CN109072215B
• 公開（公告）日: 2020-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊晟;王金剛;蔣宇;陳舒明;梁巖
• 申請（專利權(quán)）人: 山西新寶源制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/80
• 分類號: C12N9/80;C12N15/55;C12N1/21;C12P35/02;C12R1/125;C12R1/865;C12R1/84;C12R1/19
• 代理公司: 上海申浩律師事務(wù)所 31280
• 代理人: 賈師英

提供了一種通過點(diǎn)突變法構(gòu)建的頭孢菌素C酰化酶突變體，其氨基酸序列分別為SEQ ID NOs:3?12。相比野生型頭孢菌素C酰化酶，這些突變體底物特異性和酶活力得到了提高，能用于以頭孢菌素C為底物催化生產(chǎn)7?氨基頭孢烷酸。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及通過點(diǎn)突變法構(gòu)建的頭孢菌素C酰化酶、及其用于一步酶法生產(chǎn)7-ACA(7-氨基頭孢烷酸)的應(yīng)用。

背景技術(shù)

頭孢類抗生素是現(xiàn)在應(yīng)用最廣泛的β-內(nèi)酰胺類抗生素，該類抗生素大部分是通過7-氨基頭孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，簡稱為7-ACA)合成的7-ACA衍生物，這類抗生素占到了全球抗生素市場40％的份額。

7-ACA一般通過化學(xué)法或生物酶法裂解頭孢菌素C(Cephalosporin C，簡稱為CPC)，脫去分子側(cè)鏈而獲得。因化學(xué)法工藝復(fù)雜、能耗高，污染嚴(yán)重，近幾年來，工業(yè)生產(chǎn)7-ACA基本已替換為生物酶法制備。目前使用的生物酶法又分為兩步酶法和一步酶法。兩步酶法采用得較早，主要用到D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase，以下簡稱為DAAO)和戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸(Glutaryl-7-Amidocephalospranic Acid，以下簡稱為GL-7-ACA)酰化酶，CPC在DAAO的作用下生成GL-7-ACA，然后再在GL-7-ACA酰化酶的作用下脫去側(cè)鏈，生成7-ACA。雖然該方法因環(huán)保、低能耗、高收率等特點(diǎn)已經(jīng)基本取代了化學(xué)法，但該方法中DAAO催化反應(yīng)的副產(chǎn)物H₂O₂對CPC有降解作用，且為兩步催化反應(yīng)，步驟較為復(fù)雜。因此，人們開發(fā)出了一步酶法制備7-ACA的技術(shù)，即利用CPC酰化酶催化CPC脫去側(cè)鏈，生成7-ACA。

自20世紀(jì)80年代以來，人們從自然界中發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)CPC酰化酶(頭孢菌素C酰化酶)的菌株，如Pseudomonas sp.SE83、Pseudomonas diminuta N176、Pseudomonas sp.P130等，但這些酶嚴(yán)格來說是GL-7-ACA酰化酶，它們的CPC酰化酶活力均比較低，只有GL-7-ACA酰化酶活力的2-4％。迄今為止，自然界尚未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)高催化活力的CPC酰化酶野生菌。野生型的CPC酰化酶還不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)CPC的要求，因此一步酶法至今不能完全取代兩步酶法來大規(guī)模生產(chǎn)7-ACA。現(xiàn)在對Pseudomonas sp.SE83來源的CPC酰化酶改造的研究相對比較多，通過改造篩選，CPC酰化酶活性較野生酶提高了幾十倍，但該類型的CPC酰化酶都有很強(qiáng)的7-ACA產(chǎn)物抑制性。該酶活仍然無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有一步酶法生產(chǎn)7-ACA技術(shù)中的上述缺陷，得到酶活性更高、底物特異性更高的CPC酰化酶，本發(fā)明利用基因工程技術(shù)來對微生物來源的野生型CPC酰化酶進(jìn)行改造和篩選，構(gòu)建高酶活性的CPC酰化酶突變體，從而實(shí)現(xiàn)一步酶法生產(chǎn)7-ACA的工業(yè)化。

為此，本發(fā)明通過隨機(jī)突變、半理性設(shè)計(jì)等技術(shù)對假單胞菌130菌株(Pseudomonassp.130)來源的GL-7-ACA酰化酶(SEQ ID NO：1)進(jìn)行改造，獲得以CPC作為特異性底物的高酶活的CPC酰化酶突變體，以便高效地將CPC催化生成7-ACA。

因此，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種用于生產(chǎn)7-ACA的高酶活力的CPC酰化酶突變體。

本發(fā)明的第二個目的在于提供編碼上述CPC酰化酶突變體的基因。

本發(fā)明的第三個目的在于提供包含上述基因的質(zhì)粒。

本發(fā)明的第四個目的在于提供轉(zhuǎn)化了上述質(zhì)粒的微生物。

本發(fā)明的第五個目的在于提供上述CPC酰化酶突變體或微生物在生產(chǎn)7-ACA中的用途。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下頭孢菌素C酰化酶：