[發(fā)明專利]非破壞性種子基因分型

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201780021574.9
• 申請(qǐng)日: 2017-03-29
• 公開（公告）號(hào): CN109154020B
• 公開（公告）日: 2022-12-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: R·柯赫;P·埃靈格;N·詹森;S·雷;K·范德梅倫;M·克勞森
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 巴斯夫歐洲公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806;A01H1/04;A01H5/10
• 代理公司: 北京市中咨律師事務(wù)所 11247
• 代理人: 史文靜;黃革生

提供在基本上不影響所分析的種子后續(xù)萌發(fā)情況下，從單粒種子可靠釋放母方和/或父方DNA的方法和手段。該方法特別地適用于小粒谷物(包括小麥)的基因組分析。該方法可以包括改善DNA回收的酶促處理。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物的分子基因組分析領(lǐng)域。提供在基本上不影響所分析的種子后續(xù)萌發(fā)情況下，從個(gè)體種子可靠釋放母方和/或父方DNA的方法和工具。該方法特別地適用于小粒谷物(包括小麥)的基因組分析。這些方法可以用于多種情形下，包括用于育種工作中。

背景

種子工業(yè)中研究和開發(fā)活動(dòng)日益利用基因組分析鑒定并追蹤具有改善和/或所需特征的的植物。可以通過傳統(tǒng)育種技術(shù)、誘變、轉(zhuǎn)化等獲得這類特征。傳統(tǒng)上，這些過程期間對(duì)小植物或植物進(jìn)行基因組分析，所述小植物或植物已經(jīng)生長到充分發(fā)育的狀態(tài)以允許在損傷植物的情況下對(duì)組織采樣。在鑒定所需的植物后，允許這些植物進(jìn)一步生長并結(jié)種，同時(shí)棄去不想要的小植物或植物。就使用溫室或其他生長設(shè)施中的寶貴空間而言，這種過程相當(dāng)無效率。

也可以從單粒種子(individual seeds)分離DNA，但是較早的分離程序?qū)е缕茐姆N子。因此，開發(fā)了涉及不損傷胚萌發(fā)并發(fā)育成植物的能力情況下，對(duì)種子部分采樣的方法。對(duì)采樣的部分或種子碎片進(jìn)行DNA分析。使用例如自動(dòng)化切割裝置或激光束，分離種子碎片。WO2011/082316、WO2011/l 19763、WO20111/163326、WO2012/122156、WO 2014/071271中描述了這類方法。

美國專利8,959,833和7,703,238描述了一種分析種子群體中單粒種子的高通量非破壞性方法，所述方法包括使用自動(dòng)采樣器，從群體中的每一個(gè)或多個(gè)單粒種子取出組織樣品，同時(shí)保留一粒或多粒已采樣種子的的萌發(fā)活力，并且對(duì)一份或多份組織樣品分析表示至少一個(gè)遺傳或化學(xué)性狀的一個(gè)或多個(gè)特征的存在或不存在。

名為“從植物組織分離DNA的酶促方法”的WO2004/056984描述了利用細(xì)胞壁降解酶的混合物從植物組織分離DNA的方法。本發(fā)明也涉及從植物組織分離DNA的試劑盒，其中試劑盒包含細(xì)胞壁降解酶的混合物。本說明書提出向種子應(yīng)用這些方法。

Manen等人2005(BMC Plant biology 2005 5.23)描述了一種從植物組織提取DNA的充分自動(dòng)化的酶促方法。

Zheng等人(BioTechniques 58:234-243,2015)公開了通過對(duì)修飾的96孔板中固定的未萌發(fā)種子的少量子葉組織采樣，對(duì)棉花種子進(jìn)行非破壞性高通量DNA提取和基因分型的方法。孔中固定種子包括施加水溶性膠。使用基于氫氧化物的DNA提取過程，以基于平板的樣式處理采樣的量。在基于PCR針對(duì)SNP(KASP測(cè)定法)和簡單序列重復(fù)(SSR)的基因分型之前，稀釋等分試樣。

名為“從玉米種子非破壞性分離DNA”的WO2014/195199涉及從生物材料如種子分離DNA，同時(shí)保留活種子供進(jìn)一步使用的系統(tǒng)和方法。從中分離出DNA的種子仍有活力并且基于浸種溶液的DNA分析而使用或棄去。浸種溶液可以基本上具有通過使用完整的種子預(yù)處理從浸種溶液消除的來自種子的全部混淆性母方DNA。認(rèn)為這種方法特別可用于玉米種子。公開的方法共同具有以下步驟：暴露種子胚乳并在非破壞性DNA釋放溶液中浸泡種子。在實(shí)例中，DNA釋放溶液是堿性溶液，包含20mM NaOH。

盡管可獲得以非破壞性方式進(jìn)行種子基因分型的幾種方法，仍需要備選和/或改進(jìn)的更可靠和更穩(wěn)健的從種子、尤其谷物種子如小麥種子分離DNA(包含父方DNA)的技術(shù)。

[10].如以下多種實(shí)施方案、實(shí)施例和權(quán)利要求中所述，本發(fā)明提供這類方法。

發(fā)明簡述

在第一實(shí)施方案中，提供分離核酸的方法，所述方法包括從小粒谷物種子分離核酸(包括DNA)和/或提供分析小粒谷物種子群體的方法，所述方法包括步驟